糖尿病肾病足细胞损伤与Nephrin 蛋白

　糖尿病肾病(diabetic nephropathy ,DN) 是糖尿病的严重并发症,导致糖尿病患者致死、致残的主要原因之一[1] 。尿蛋白排泄率逐年增加，肾功能减退至终末期肾病是其主要临床特点。既往研究认为肾小球基底膜( glomerular basementmembrane , GBM) 成分改变及细胞外基质( ext racellular mat rix ,ECM) 聚积是糖尿病肾病的关键性改变。然而这些因素仅能解释30 %～50 %的尿白蛋白排泄率和肾小球滤过率的变化。近年来研究发现，足细胞(podocyte) 超微结构改变及其相关分子表达变化在糖尿病肾病蛋白尿产生及发展过程中起重要作用[2]。下面就足细胞与其主要分子Nephrin 蛋白作一综述。山东中医药大学附属医院肾内科郭兆安

1. 足细胞

足细胞及其之间的裂孔隔膜是肾小球毛细血管壁的一部分。肾小球毛细血管壁自内而外有三层屏障: 有窗孔的肾小球内皮细胞、肾小球基底膜（GBM)、足突及覆盖于足突裂隙间的裂孔隔膜( slit diaphragm , SD) 。多年来认为,由于GBM 限制了大的血浆蛋白和带阴电荷的蛋白，故对肾小球滤过屏障起重要作用。近20 余年又提出GBM的改变及足突与GBM 的脱开是蛋白尿的原因。但最近几年关于蛋白尿的研究多以足细胞为重点,特别是足细胞裂孔间的SD 被视为是分子屏障中最关键的部分[3] 。

1.1 足细胞的生理功能  足细胞是肾小球中最大的细胞，贴附于基底膜的外侧，细胞呈多突状，足细胞分为结构和功能不同的3 个部分：细胞体、主突和足突。主突的微管连接着足突中以肌动蛋白为主的细胞骨架系统来维持和改变足细胞的形态，调节足突运动。相邻两足突间的距离25～60 nm，这个裂隙由一层薄膜连接，即裂孔隔膜，裂孔隔膜是大分子蛋白的主要滤过屏障。裂孔隔膜为蛋白质三维结构,其中横桥呈高度有序、周期循环地相互交联而形成其拉链样外观。足细胞表面覆有一层具有高度负极性的上皮细胞聚阴离子层，其对肾小球电荷屏障的形成、相邻足突间裂孔隔膜结构的维持有重要意义，是参与维持肾小球滤过膜电荷屏障的物质基础[4]。

1.2 糖尿病肾病足细胞损伤的病理特点

研究发现在糖尿病早期，肾小球体积就增大，尽管此阶段足细胞数目尚无明显变化，但足细胞及其胞核体积增大，密度减少，这种改变在糖尿病病程较长，但尿白蛋白排泄正常的患者中就已存在。随着DN 微量白蛋白尿的出现，足细胞数目开始减少，残留足细胞为覆盖面积增大的基底膜而代偿性肥大、足突增宽，进而使肾小球滤过屏障通透性增加，导致大量蛋白尿发生，大量蛋白尿又反过来加重足细胞损伤。足细胞损伤后会发生一系列的表型改变，足突融合，回缩，消失，胞体缩小，假囊形成，阴离子电荷减少，足细胞从基底膜上脱落，使基底膜区域性裸露，裂隙膜遭到破坏，大量蛋白从此滤过，使肾小球形成“高滤过、高灌注和高跨膜压”，最终形成肾小球硬化、肾功能进行性丧失[5] 。

足细胞裂孔隔膜改变  裂孔隔膜是构成肾脏选择性滤过屏障的关键结构，由位于足细胞胞外间隙一系列蛋白复合物所构成，这些蛋白质分子的相互作用不仅对维持足细胞正常的结构和生物学功能具有重要意义，而且与肾小球疾病蛋白尿的发生有密切关系。大量证据表明,nephrin - CD2AP - podocin 复合物是将裂孔膜铆钉于足细胞肌动蛋白骨架上的关键功能单位,是维持肾小球正常滤过功能的必要条件。相关蛋白表达及分布异常可以导致足细胞裂孔隔膜的不完整性，最终导致蛋白尿的发生。动物实验中,发现糖尿病大鼠随着肾脏损害的进展，nephrin 的表达显著降低，并且与尿中白蛋白尿增加有关[6]。

足细胞细胞骨架蛋白改变  蛋白细胞骨架是真核细胞维持生命活动的重要组成成分。细胞骨架正常分布使细胞维持特有的形态和弹性,占一定的空间方位,并使细胞粘着、识别和通讯。有学者用荧光染料双重标记F - actin 和vimentin，并以激光共聚焦显微镜观察其在糖尿病大鼠肾小球足细胞和系膜细胞中的分布，并与正常大鼠进行比较,结果发现糖DN 足细胞和系膜细胞中vimentin 和F - actin 的分布与正常时相似,但足细胞中含vimentin 成分的束状纤维密度减低、变细且分布不规则，系膜区含F - actin 的纤维组装异常极为明显，提示细胞骨架蛋白的重分布及其去组装参与肾小球毛细血管血流的重分布，可能是糖尿病时肾小球高灌注的原因之一[7] 。

2. Nephrin

近年通过对一些早发的肾病综合征关键基因及其蛋白产物(特异性表达于足细胞者) 的分子遗传学、分子生物学的研究，发现SD的完整的结构和功能对肾小球的滤过屏障起重要作用。SD是肾小球滤过屏障的重要结构和功能单位，由nephrin、Podocin、CD2AP、FAT、P- cadherin 等多种蛋白质组成，被称为“ 足细胞相关分子”[8]，这些蛋白质分子的相互作用对维持足细胞正常的结构和功能具有重要意义；编码这些蛋白质分子的基因突变和/ 或表达改变则可导致遗传性或获得性肾脏病，而有学者认为SD 中主要成分nephrin 的发现开辟了对蛋白尿发病机制研究的新纪元。

2.1 Nephrin 的结构

Nephrin 属于免疫球蛋白超家族分子，为一跨膜蛋白，人Nephrin 长1 241个氨基酸残基，包括胞内区、跨膜区和胞外区。其C 端为胞内区，N 端为胞外区。胞外区从N 端开始含有6 个连续的Ig 区,再接1 个间隔区，接着又有2 个Ig区,随后为1 个纤连蛋白Ⅲ区。每个Ig 区内含2 个半胱氨酸残基，相互可形成二硫键，使每个Ig 区形成直径为214～417nm 的圆形或椭圆形结构。在第1 个Ig 区、间隔区及跨膜区各有1 个游离的半胱氨酸残基，它们可能与分子间的相互作用有关。Nephrin 的胞内区含有9 个酪氨酸残基, 推测当Nephrin 与配基结合时,可能使其中某些酪氨酸残基发生磷酸化而起到信号传导作用。Nephrin 属于免疫球蛋白超家族的C2 型,该型分子与细胞与细胞或细胞与基质的粘附或相互作用有关。Nephrin 的相对分子质量为185 000，但根据其氨基酸序列推定的相对分子量约为130 000。其分子结构中有10 个可能进行糖基化的位点，故推测分子量的差异与其高度糖基化有关。研究表明Nephrin 含有较多的阴离子,这些阴离子可能由硫酸类肝素提供[9]。大鼠Nephrin 长1 234 个氨基酸残基，与人Nephrin 的氨基酸序列有89 %的一致性。其中，胞外区、跨膜区和胞内区的一致性分别为90 %、99 %和83 %。胞外区的Ig 区和纤连蛋白Ⅲ区的序列高度保守。半胱氨酸的位置也高度一致，但大鼠Nephrin另外还有2 个半胱氨酸。此外,它们的糖基化位点的分布也一致。

2.2 Nephrin 的分布

用Northern 杂交的方法检测人的心、脑、肺、肝、肌肉、肾、胰腺和胎盘组织，发现仅胎儿和成人的肾组织有Nephrin 的mRNA 表达。应用原位杂交的方法检测胎儿的肾组织,发现仅肾小球有Nephrin 的mRNA 表达，其分布部位与脏层上皮细胞的分布相似。应用重组表达的Nephrin N 端片段作抗原制备的抗体作免疫电镜检查，证实Nephrin 仅分布于脏层上皮细胞足突之间的裂隙膜部位，证明Nephrin 是裂隙膜的结构成分。应用针对Nephrin 胞内区的多克隆抗体作大鼠肾组织免疫组化检查,表明Nephrin 仅分布于肾小球。免疫荧光足细胞均有Nephrin染色，抗细胞内肾小球隔膜抗体染色显示其非均匀分布于细胞内，以颗粒状和线性沿细胞骨架分布，并且有聚集中心团块状分布，可在细胞核周围，细胞分裂器可见[10]。

2.3 Nephrin 与足突裂孔隔膜结构

根据Nephrin 的分子结构，Tryggvason[11]推测Nephrin 在裂隙膜中的结构方式。Nephrin的胞外区伸展于裂隙孔中，与相对足突上伸出的Nephrin 分子发生相互作用，第1 Ig 区上的游离半胱氨酸可与对侧足突上伸出的Nephrin 间隔区上的游离半胱氨酸形成二硫键，而后者的第1 Ig 区的游离半胱氨酸，可与这一侧足突伸出的另一个Nephrin 的间隔区上的游离半胱氨酸形成二硫键，通过如此重叠作用，在足突裂隙孔部位即可形成拉锁状结构。第1 至第6 Ig 区重叠分布而构成紧密的中央线状结构，该紧密重叠区域的宽度约为1415～24nm。在此紧密区与足突之间，从同一足突伸出的相邻的2 个Nephrin 分子的间隔区、第7 Ig 区、第8 Ig区之间可形成孔隙，该孔隙具有一定的伸展性。此外，Nephrin 分子含大量阴离子，因此，SD不仅是孔径屏障，还可能具有电荷屏障的作用。

电镜研究结果显示nephrin 分子在裂孔区形成拉链样多孔滤过结构，这对于维持裂孔隔膜的结构完整性起关键作用。Nephrin 基因突变导致蛋白缺失，使滤过屏障破坏从而引起大量蛋白尿[12]。

2.4 Nephrin 与其它相关蛋白分子

最近发现Nephrin与Podocin、CD2AP、actinin4 互相结合构成肾小球滤过屏障的主要成分,对高度特异性的足细胞功能发挥起到关键性作用，与肾病发生关系密切。Nephrin 与上述蛋白的相互结合破坏，可以导致细胞骨架与足突的重排，从而引起肾小球滤过膜形态结构与功能完整性的破坏[13]。

3. Nephrin 与糖尿病肾病（DN）

3.1 nephrin 与蛋白尿  DN在临床上以蛋白尿和肾功能损害为特征，蛋白尿或白蛋白尿的产生反应了肾小球选择通透性增加，人类和动物实验已表明足突细胞结构改变与蛋白尿或白蛋白尿的产生有关联，新近进一步研究表明DN 中肾脏nephrin 表达改变和蛋白尿之间存在联系。有人用数字影像免疫荧光强度方法观察23 例DN 患者肾活检标本nephrin 表达，发现无论表现为肾病综合征还是微量白蛋白尿的Ⅰ和Ⅱ型DN 患者其肾小球nephrin 表达显著下调，而表现微量白蛋白尿患者无显著肾小球组织学损害，并且发现nephrin 于DN 呈颗粒状分布，而在正常肾组织中呈斑点/ 线状分布，所以认为nephrin 表达下调和重分布先于肾小球组织损害并且是糖尿病肾病进程的早期事件，nephrin 表达量与蛋白尿程度显著负相关[14]。而Donblier 等[15]研究提示DN 的早期存在nephrin 表达异常和重分布,并可能促进肾小球滤过功能的丧失,但后期肾小球nephrin 表达下调伴随着尿蛋白的增加,其可能机制为: ①nephrin 在DN 的快速重分布和从细胞表面的脱落依赖于Ang Ⅱ刺激细胞表面的骨架蛋白; ②通过GA - RAGE 相互作用抑制nephrin 基因转录。

3.2 nephrin 和RAS 关系  大量糖尿病动物实验和人类研究已证明ACEI 和/ 或ARB抑制RAS，能有效降低蛋白尿/ 白蛋白尿，阻止DN的发展，从而发挥积极的肾脏保护作用。如缬纱坦(valsartan) 可使尿白蛋白排泄率下降，并且阻止nephrin 表达的下调。有人体外实验发现Ang Ⅱ诱导高糖环境下培养的人类肾小球上皮细胞nephrin 重分布和短暂缺失。以上部分说明RAS 阻滞剂包括受体拮抗剂降低蛋白尿作用与缓解nephrin 表达有关。而降低Ang Ⅱ的合成或活性，恢复nephrin表达可能是通过调节肾微循环，降低肾小球滤过压和/ 或直接影响足突细胞实现的。

3.3　nephrin 与晚期糖基化终末产物受体(RAGE)  Doublier 等于体外高糖环境培养人类肾小球足突细胞，nephrin 表达主要表达于细胞基底侧；当与糖化蛋白共孵育1 小时并无nephrin 表达改变,但24 小时后却显著降低，同时发现细胞有RAGE 的表达，用抗RAGE 抗体结合后能预防糖化蛋白诱导的nephrin 表达的下调。

3.4 nephrin mRNA 在2型糖尿病肾病中的表达  原位杂交定量分析的方法，观察13 例2 型糖尿病肾病病人及5 例微小病变肾病(MCNS) 、5 例正常肾组织,显示Nephrin mRNA阳性细胞仅位于肾小球上皮细胞，Nephrin mRNA 阳性百分比在2 型DN 明显低于MCNS 和正常肾组织；Nephrin mRNA 阳性百分比与蛋白尿及肾损害的程度呈负相关。又有实验显示nephrin 和podocin 无论在蛋白质水平还是mRNA 表达方面，两者呈平行变化，说明nephrin 作为一种信号蛋白，与podocin 密切相关，两者共同表达或分泌才能将信号传递到胞内CD2结合蛋白，随后又通过辅肌动蛋白( ACTN4 ) 与肌动蛋白相连，以保持足突处于正常功能状态[2]。

4. 糖尿病肾病的治疗

在糖尿病肾病中，肾脏足细胞及其间的裂孔隔膜的损伤是造成蛋白尿和导致肾功能下降的重要原因，裂孔隔膜中蛋白的表达异常和重分布可导致其完整性遭到破坏，而nephrin 就是一主要蛋白。故糖尿病治疗中可从调整nephrin 蛋白的信号转导机制着手，从而调整nephrin 表达和分布，恢复裂孔隔膜的完整性，从而延缓肾脏病的进展。

4.1 ACEI、ARB 对足细胞nephrin 表达的影响  目前，在DN 的治疗措施中以ACE I、ARB 的应用最为广泛，起着决定性的关键作用。其中ARB 通过阻断ATⅡ与其1受体结合而抑制ATⅡ的致病作用，在降低2型糖尿病患者发生DN甚至终末期肾脏病等方面独立于降压之外的作用。有研究显示自发性高血压大鼠在诱导糖尿病后nephrin 基因除早期短暂升高外，24周后明显下降,并且与尿白蛋白增加有关。厄贝沙坦干预糖尿病肾病大鼠（8周），其足细胞nephrin表达量明显减少，表明厄贝沙坦等ARB 制剂对DN的肾保护作用机制可能与调节DN状态下足细胞nephrin的表达量有关，通过延缓或抑制nephrin蛋白的损伤、维护足细胞结构和功能的完整而发挥减少尿蛋白、延缓DN进展的作用[16]。

4.2 罗格列酮对nephrin 表达的影响  罗格列酮治疗糖尿病肾病大鼠4周后，DN 大鼠尿蛋白排泄减少，足突宽度变小，基底膜平均厚度降低，足细胞数基本恢复正常，治疗8周后上述变化更加明显，结合罗格列酮干预后大鼠血清肌酐浓度下降，提示罗格列酮可以通改善足细胞结构而减少尿蛋白排泄，减轻高血糖所致的肾损害。同时罗格列酮能使肾组织中nephrin、podocin 蛋白及nRNA 表达上调，呈时间依赖性。提示罗格列酮可能通过诱导nephrin 及 podocin 表达增加而减轻蛋白尿[17]。

4.3 辛伐他汀对nephrin mRNA 表达的影响  有学者[18]研究辛伐他汀治疗4 周及8 周DM鼠，nephrin mRNA 的表达量较非治疗DM 组8周组明显升高，且接近正常对照组，推测辛伐他汀可诱导nephrin mRNA 的表达。辛伐他汀除了可以降低动物血浆胆固醇外，还有增加nephrin mRNA 表达的作用，且糖尿病大鼠血浆胆固醇浓度与nephrin mRNA 表达量呈负相关，辛伐他汀可能是通过降低血浆胆固醇浓度提高nephrin mRNA 的表达，从而减少尿蛋白，保护糖尿病肾脏。

4.4 1, 25-(OH) 2D3 对nephrin mRNA 表达的影响  研究表明[19]，1, 25-(OH) 2D3 有肾保护作用:抑制MC及足细胞增殖，减少足细胞丢失及肥大，通过抑制肾素生成,下调肾素-血管紧张素系统(RAS)系统；阻止肾小球肥大；降低慢性肾疾病(CHD)蛋白尿；调节Smad3和TGF2β，降低纤维细胞因子生成。且1, 25-(OH)2D3能减少DM大鼠Nephrin表达缺失,减轻足细胞的损伤脱落,维持SD结构的完整,进而减少尿红细胞及尿蛋白的排泄。

另外，有研究显示nephrin 信号转导和 nephrin/podocin 二者协同信号转导路径相同，突变基因分析显示nephrin/podocin 复合体信号转导异常导致足细胞功能异常和蛋白尿。所以从其它相关蛋白入手可作为糖尿病肾病治疗的思路[20]。

结语  糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症，临床上以蛋白尿和肾功能损害为特征，而近年的研究显示足细胞超微结构和功能的改变在其发病机制中占有重要地位，而自从1998年Karl[20]发现第一个裂孔隔膜蛋白Nephrin 以来，对肾小球滤过屏障的选择性通透和蛋白尿的发生机制有了更深入的理解，并为防治遗传性和获得性肾脏病提供新的方法。可通过nephrin 基因敲除或基因敲入小鼠可用来阐明肾小球足细胞的发育和先天性肾病变的发病机制，进一步阐明其在疾病中的作用。更重要的是研究nephrin 及其它蛋白具体的细胞信号转导通路，从而为糖尿病肾病的治疗提供靶点。

 

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