鼻敏片对大鼠变应性鼻炎鼻黏膜ICAM-1、VCAM-1表达的影响

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是特异性个体接触原后由IgE介导的介质释放为开端的、有多种免疫活性细胞和细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病。以反复阵发性喷嚏、流涕、鼻塞和鼻痒为主要特点，部分患者有嗅觉减退。AR人群患病率为 10%~40%。我国发病率为37.74%。国际变态反应学界对细胞粘附分子及其与变态反应性疾病的关系研究表明，白细胞内皮粘附分子在炎症细胞迁移到变态反应局部组织中起重要作用，主要包括细胞间粘附分子1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)。近10多年来，我们在临床上使用协定处方鼻敏片治疗效果良好。本研究旨在观察鼻敏片对变应性鼻炎鼻黏膜ICAM-1、VCAM-1表达的影响，以探讨其作用机制，现将实验方法及结果报道如下。  湖南中医药大学第一附属医院耳鼻咽喉科李凡成

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  动物 

S D大鼠60只，清洁级，雌雄各半，体质量180～210g，由湖南中医药大学动物实验中心提供。随机分为5组，设空白组、模型组、鼻敏片低剂量组、鼻敏片高剂量组、 开瑞坦组，每组10只。余10只用于被动皮肤免疫反应试验（PCA试验）。 

1.1.2  药物 

鼻敏片，1.5 g （含生药）／片,实验给药前去糖衣,用生理盐水溶解,由湖南省中医院药剂科制备。开瑞坦，主要成分氯雷他定，由上海先灵葆雅制药有限公司生产，给药前用生理盐水溶解。 

1.1.3  试剂  

卵清白蛋白，氢氧化铝 ，ICAM-1单克隆抗体1，LFA-1单克隆抗体，SP试剂盒,，DAB显色试剂盒，0.1 M  PBS，0.01M枸橼酸盐缓冲液。 

1.1.4  仪器  

GC 一 1200γ放射免疫计数器，2010型高效液相色谱仪；Olympus BH系列双目光学显微镜，离心机，恒温水浴箱，切片机，电子天平，可调移液器，恒温箱，湿盒。 

1.2  方法

1.2.1  A R动物模型的建立  

全身致敏：将0.3 mg卵清蛋白溶于1 mL生理盐水，以3 0 mg氢氧化铝为免疫佐剂对模型组、空白组、鼻敏片低剂量组、鼻敏片高剂量组（简称鼻敏低组 、高组）、开瑞坦组大鼠行腹腔注射，空白组以1 mL生理盐水加30 mg氢氧化铝行腹腔注射，隔天1次，连续7次。局部抗原攻击：腹腔注射免疫完成后，并确定IgE抗体效价升高，将卵清蛋白（卵清蛋白20 mg + 生理盐水20 L，正常对照组用生理盐水）滴入大鼠两侧鼻孔，每次每侧10μL，每天1次，连续用药 7d后，改为隔天1次，直至实验结束。

1.2.2          动物分组及给药方法 

空白组在治疗期间不变，其余各组在激发实验第7日后起改为隔日激发1次（维持），给药方法按临床用药，以60k g成人为标准，按照体表面积一剂量换算法计算给药剂量灌胃。鼻敏片低剂量组为临床等效剂量，低、高剂量比例为 1：2 。各组均为10只，空白组生理盐水灌胃1m l／(0.1 k g?d )，模型组生理盐水灌胃 l mL／( 0.1 kg?d ) ，鼻敏片低剂量组鼻敏片(1：1)灌胃l m l ／(0．1 kg?d )，鼻敏片高剂量组鼻敏片(1：2 ) 灌胃 1 mL ／(0.1 kg?d ) ，开瑞坦组开瑞坦灌胃1 mI ／(0.1k g?d )。 

药物剂量换算公式：大鼠剂量(g／kg ) = [人剂量( g／kg)×人转换因子(36 )]／大鼠转换因子(6)；根据大鼠每日剂量及每公斤体质量灌胃所能耐受的容量体积配制药物浓度,各组给药次数Bid，疗程为15d 。 

1.2.3  取材及组织病理标本制备  

于末次致敏30 mi n后所有动物颈动脉放血处死，游离出上颌骨，沿鼻中线剪开鼻腔，取出鼻中隔，放人4％多聚甲醛固定。 

1.2.4  免疫组化染色  

各组标本的石蜡切片经处理后，按照SABC试剂盒所示方法进行。 

1.3  统计学分析

实验数据均先经方差齐性检验，在方差相同的情况下，采用单因素方差分析统计方法，方差不齐时采用非参数统计方法和秩和检验。自身前后对比采用t检验。数据整理、统计、分析采用SPSS 1 1 ．5软件进行处理。 

2  结果

采用卵清白蛋白经腹腔内注入致敏及鼻腔滴入激发成功复制出变应性鼻炎的模型；ICAM-1主要在黏膜上皮细胞固有层炎性细胞及血管内皮细胞胞膜上表达；VCAM-1主要在固有层血管内皮和内皮细胞上表达。ICAM-1、VCAM?l在各组的表达。表中显示，ICAM-1 在各组的表达比模型组低，差异具有统计学意义（P < 0.01），鼻敏片低、高剂量组阳性细胞所占面积均低于开瑞坦组，差异具有统计学意义（P < 0.05）；各组VCAM-1阳性细胞所占面积均低于模型组。差异具有统计学意义（P < 0.01），鼻敏片高剂量组VCAM-1表达低于开瑞坦组，差异具有统计学意义（P < 0.01），鼻敏片低剂量组VCAM-1表达与开瑞坦组差异无统计学意义（P >0.05），结果见表 l 。 

表 1  鼻敏片对备组大鼠ICAM -1 、 VCAM-1表达的比较

 

注： 与空白组比较 * P <0.05 ，**P <0.01；与模型组比较# # P <0.01；与开瑞坦组比较?P < 0.05，??P < 0.01。 

3  讨论

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员之一，是LFA -1的配体，以配体一 受体相对应的形式发挥作用。在变态反应性炎症中，通过ICAM-1与LFA-l结合，使T细胞粘附于抗原提呈细胞、内皮细胞、上皮细胞和各种靶细胞。进而以嗜酸性粒细胞等选择性聚集于炎症和免疫反应局部，引发变态反应的发生。ICAM-1对变应性炎症中嗜酸细胞的聚集有重要的作用，嗜酸性粒细胞表面的LFA-1受到刺激后迅速上调，与内皮细胞表达的ICAM-1相互作用，有助于嗜酸性粒细胞粘附，在嗜酸性粒细胞通过内皮细胞间隙时起关键作用。本实验结果表明，模型组( Ⅱ组) 的鼻黏膜上皮细胞、固有层炎性细胞及血管内皮细胞均大量地表达ICAM-1，而鼻敏片低、高剂量组与模型组之间ICAM-1的表达有明显差异，提示鼻敏片能通过抑制ICAM-1的表达阻止嗜酸性粒细胞等炎性细胞的粘附浸润来发挥其治疗作用。 

VCAM-1亦属于免疫球蛋白超家族成员。是VLA -4的配体，主要表达在细胞因子活化的血管内皮细胞表面，能介导淋巴细胞和白细胞与内皮细胞的粘附作用。VCAM-l在变应性炎症中嗜酸性粒细胞的聚集上有重要的作用，它在血管内皮的表达被认为是嗜酸性粒细胞从外周血进入炎症区所必需的，VCAM-1能选择性地把嗜酸性粒细胞粘附至内皮细胞上。本实验结果发现模型组鼻黏膜固有层血管内皮及内皮细胞有较强的阳性着色，与模型组相比，鼻敏片低、高剂量组VCA M-1的表达明显减弱，且鼻敏片高剂量组VCAM-1的表达与空白组无明显差异。这表明鼻敏片对鼻黏膜的VCAM-1的表达有抑制作用，并且通过此来阻止嗜酸性粒细胞的粘附、浸润。 

鼻敏片是根据中西医结合病理与现代中药药理研究进展的成果，按照辨证论治与辨病论治相结合的思路进行遣方组药，根据本病多是脾肾不足、肺卫不固为本，风寒异气侵犯为标 的本虚标实病证，以标本同治为治则，温肺祛风、补肾健脾、摄津止涕为治法，使其祛邪而不伤正，扶正而不助邪。其作用机制经本实验证明，鼻敏片能抑制变应性鼻炎大鼠鼻黏膜ICAM-1 、VCAM-1的表达。