肿瘤细胞多药耐药机理的研究进展

 

    在肿瘤的治疗方法中，化疗占据着不可替代的地位。自从化疗药物应用于临床以来，虽对少数恶性肿瘤的治疗取得了成功，但在大多数恶性肿瘤中收效却不大，这其中1个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。1970年 bielder和 riehm发现， p388细胞及中国仓鼠肺细胞对放线菌素 d产生抗药性的同时，对结构与作用机理不同的药物如长春新碱、丝裂霉素等也产生交叉抗药性（1），这与以往认为的肿瘤细胞只对同1类型的药物产生抗药性，而对不同类型的药物仍敏感的观点不同，这种现象即被称为多药耐药（ multidrug resistance， mDR）。近年来，随着对肿瘤药物治疗的进一步研究，探索肿瘤细胞多药耐药的机理并加以有效逆转，已成为肿瘤研究领域急待解决的问题。现对近些年肿瘤多药耐药机理的研究情况加以概括，希望对以后的研究有所帮助。 1 p-糖蛋白和 mdr1基因 　　1976年 juliano等在研究中国仓鼠卵巢细胞（ cHO细胞）对秋水仙碱和其它作用于膜的药物的交叉耐药性时发现，具有交叉耐药性的细胞内药物积聚发生障碍，进一步研究发现这种细胞表面有1种分子量为170KD的糖蛋白存在，这种糖蛋白只在变异的具有交叉耐药性的 cHO细胞表面存在，而在原代 cHO细胞表面则没有，作者将其命名为 p-糖蛋白（ p-glycopro-tein， p170），并认为这种糖蛋白可以改变细胞膜疏水区对药物的通透性（2）。1986年美国国立癌症研究院发现了多药耐药基因 mdr1（3）。 　　现在已经知道，拥有 p170的肿瘤细胞摄入药物的能力与敏感细胞没有差异，但药物外排能力却加强，表明 p170能调节细胞膜通透性以影响药物在细胞内积聚。 p170由1280个氨基酸残基组成，其中肽链占140KD，糖链占30KD， p170的 n端与 c端形成对称结构，且氨基酸序列有高度同源性，每部分各由细胞质亲水区与跨膜疏水区组成，疏水区具有通道蛋白性质，亲水区有 aTP结合位点。因此， p170被认为在 mDR细胞中充当能量依赖性药物外排泵（4），但其具体过程尚不清楚。 　　编码 p170的是 mdr1基因，人的 mdr1基因定位在第7号染色体长臂的第2区第1带上，含28个外显子（5）。1986年 igor等用 dNA分析和 southern杂交的方法证明其转录4．4kb的 mRNA片断（6）。 takatori等研究发现 mdr1上游－131到＋10表现出启动子活性，并发现3种 dNA结合蛋白，分别为 nF-R1、 nF-R2、 nF-R3，其中 nF-R2与 mdr1基因转录激活的负调控有关，能与 mdr1基因上 aTTCAGTCA序列及 gC盒结合，而 aTTCAGTCA又被认为是 mdr1基因转录的正调控区域 a（7）。此外，又有学者证明，在 mdr1基因上游存在2个特殊区域，分别在－258～－198和－136～－76，在人 kB细胞中分别与抗癌因子和热休克有关（8）。 mdr1基因及其表达产物 p170是目前研究最多的1种多药耐药机制，逆转其作用过去曾被认为是1把双刃剑（9），因为 p170在人类正常组织如肾上腺、肾脏、回结肠、直肠、肝、肺等均有较高表达，这显然与这些组织的解毒功能有关，但目前认为这种表达在耐药肿瘤细胞中更高。　　  另外，有人在非 p-糖蛋白表达的 mDR细胞中发现了1种由1522个氨基酸残基组成的膜转运蛋白含量明显高于药敏细胞，并证明是1种细胞膜 aTP结合蛋白，也参与肿瘤耐药性的形成（10）。目前，将多种与 mDR有直接关系的蛋白（不包括 p170）如190KD、95KD、100KD等统称为多药耐药相关蛋白（ multidrug resistance-assoiated protein， mRP），它们对 mDR的影响正在越来越多地被观察到。 　　2、 dNA拓扑异构酶Ⅱ（ topoisomerase， topoⅡ） 　　topoⅡ是催化 dNA拓扑异构体相互转换的1种酶。以 topoⅡ为靶点的抗肿瘤药物的作用是通过形成稳定的可切割复合物抑制 dNA的复制与转录，通过对这类药物呈现耐药性的细胞的研究发现， topoⅡ的含量与活性有所改变，如 perry等对丝裂霉素（抗 topoⅡ）的耐药株和敏感株细胞的研究中发现，耐药株的 topoⅡ活性下降（11）。另外，在研究潘生丁增强阿霉素、米托蒽醌和鬼臼乙叉甙在耐药细胞 b16VDXR中的作用机制时， damle等认为潘生丁可与 topoⅡ相互作用，妨碍 topoⅡ抑制剂引起的 dNA破坏的修复，增强了药物的细胞毒性（12）。 fox等在研究结肠癌对米托蒽醌的耐药细胞株时，用共聚焦显微镜观察发现与米托蒽醌相关的荧光在非耐药细胞中强于耐药细胞，且主要分布在细胞质和核周围，认为米托蒽醌很可能通过慢性 topoⅡ俘获至 dNA损伤不能修复，导致临床上非典型的 mDR（13）。 　　广州医学院附属肿瘤医院胸外科薛兴阳

一般说来， topoⅡ异常所致的 mDR有以下特点：①对许多天然药物呈现抗药性，但对长春碱类则没有；②膜活性药物不能提高抗肿瘤药物的细胞毒作用；③药物在细胞内聚积与保留没有变化；④ mdr1与 p170表达未见增加；⑤ topoⅡ含量及活性均有所下降。 　　topoⅡ经纯化已得到2种有活性的同工酶，分别称做α、β，分子量分别为170KD和180KD。 　　

3 谷胱甘肽和谷胱甘肽 s-转移酶 　　化疗药物能与谷胱甘肽（ glutathione， gSH）结合而被解毒，这是在谷胱甘肽 s-转移酶（ glutathione s-transferase， gST）催化下发生的反应。 gST不仅可催化亲电物质与 gSH结合，而且 gST自身也可与亲脂性药物结合增加其水溶性，促进外排而降低抗肿瘤药物的细胞毒作用。 　　komiya等对耐顺铂的骨肉瘤细胞的研究中发现，细胞质内的谷胱甘肽和过氧化氢酶含量增高，但抑制过氧化氢酶后药物敏感性无明显提高，而抑制谷胱甘肽后药物敏感性提高70％（14）。 kuroda等在研究同一肿瘤患者化疗前后肿瘤细胞耐药情况时发现，化疗后株与化疗前株相比，对阿霉素的耐药性增加3倍，对顺铂的耐药性增加2．7倍，但未见 mdr1基因表达，而谷胱甘肽 s-转移酶（ gST）的水平明显升高，说明其化疗耐药性与 gST活性有关，而与 mdr1基因无关（15）。在耐苯丙酸氮芥的人黑色素瘤细胞中， gST水平升高， hansso等用 gST抑制剂?依他尼酸，证明可以逆转对苯丙酸氮芥的耐药。 ciaccio等也发现依他尼酸可显著增加许多 mDR细胞对烷化剂的敏感性。 　　以上均说明 gSH和 gST在一些肿瘤多药耐药机制上起重要作用。 　　

4蛋白激酶（ proteinkinaseC， pKC） 　　1994年 laredo等选用2组不同特征的 aML细胞，1组耐阿霉素，1组对阿霉素敏感，他们发现对阿霉素的耐药性与 p-糖蛋白无关，而 staurosporine（ sT）是1种 pKC抑制剂，加入 sT可使阿霉素的细胞毒性增加2－3倍，由此得出， pKC活性增强也是1种细胞耐药的机制（16）。后来发现 pKC的这种作用主要是通过使 p170磷酸化并使其功能增强而实现的， p170做为 pKC的底物，尽管数量未增加，但其药物外排功能却增强了，从而在 p170并未过度表达时也产生耐药性。 pKC主要催化丝氨酸或苏氨酸的磷酸化，有多种同工酶，如α、β、γ、ε、δ、ζ等，各自具体的作用还不清楚。 cloudHeflin等选择了 kB-3（敏感株）和 kB-V1（耐药株）2种人肿瘤细胞来研究 pKC的作用情况，用同工酶特异抗体 immunoblotting方法，发现 kB-V1中ε、δ、ζ没有变化，而α升高，与 kB-3细胞明显不同，故认为 pKC-α在 mDR表型中起重要作用（17），但这仅是对 pKC的初步了解，因其同工酶分布不同，不同的 mDR细胞中 pKC的活性变化也不一致，不同的调节因子对敏感细胞和耐药细胞可通过不同的同工酶进行调节，并很可能出现一些交替变化的不确定机制（18）。 　　

5与致癌和抑癌基因的关系 　　correntic等调查了18000例乳腺癌病人，发现有多发性癌基因改变，过度表达的是 c-myc、 int-2、 neu和 c-myb，用 slotblot分析浸润癌的 mRNA，发现30％的肿瘤同时有 mdr1和 c-myc的高水平表达（19）。 norris等也从神经肉瘤细胞的耐药性研究中证实， mRP的表达与 n-myc扩增有关，有 n-myc扩增的细胞 mRP基因表达高， mRP高表达者的5a生存率是57％，低表达者是94％，据此认为 mRP的表达情况有预后意义，而 mdr1和 n-myc则没有（20）。但上述结果却与 khyari等的研究不一致，他的研究显示， mdr-1过度表达，伴有细胞核内 c-myc、 c-myb表达减少，而 c-fos和 c-jun表达增加。这些说明 mDR与癌基因有关，但不同的情况下可能有不同的解释。另外， rafki等研究发现 p53基因的表达和功能的变异与 cEM-VLB细胞的耐药性有关，在 mDR细胞中，野生型 p53受抑制，而变异的 p53可特异地激活 mdr1启动子，与此对应，当用小剂量诱导药物长春花碱作用于这些耐药细胞时， p53基因表达增高（21）。 　　

应用不同的细胞均证明， mdr1基因与癌基因的活性有关，同时也与抑癌基因的丢失有关（22）。 　　

6与细胞生活环境变化的关系 　　

6．1与 pH值的关系 　　hamilton等通过结肠癌细胞株研究了 mDR逆转剂与细胞内 pH值的关系，在加入逆转剂的同时加入含碳酸氢盐／ cO2的林格氏缓冲液，使细胞内 pH值逐渐降低（0．1～0．3units），发现细胞内酸化可以加强细胞的化学敏感性，特别在碱性的细胞外环境下，有助于减少 mDR修饰因子的效应，同样有助于 p-糖蛋白阴性细胞的化学敏感性的提高（23）。 miller等在研究正定霉素在克鲤鱼的近端肾小管的分泌情况时，发现 pH为8．25时，细胞内正定霉素的聚集不受环孢素 a的影响，当 pH为7．25时，药物在细胞内的聚集被环孢素 a所增加，其机制可能是 pH为8．25时药物通过简单扩散穿过管侧膜，并由 mDR传输蛋白分泌入管腔，而 pH为7．25时，除扩散外，还有有机阳离子载体介导的重吸收，故而分泌减少，细胞内含量增加（24）。现在已知 p-糖蛋白的 aTP酶活性的最适 pH是7．5。 　　

6．2温度的关系 　　p-糖蛋白有药物刺激性 aTP酶活性，其作用位点对核苷酸有低亲和力和低特异性， vrbatsch等从富含 p-糖蛋白的中国仓鼠卵巢浆膜中发现钒酸盐可诱导俘获核苷酸，可稳定抑制 p-糖蛋白的合成，而若恢复 p-糖蛋白的活性，37℃时需84min，4℃时超过30h（25），说明 aTP酶的恢复与俘获的核苷酸的释放和温度有关。 　　

加温能使细胞膜流动性增加，稳定性下降，通透性增加，提高化疗药物的渗透和吸收；温度升高，不仅加快了药物的摄取和药物反应速度，而且可减少 dNA断裂的修复，加温还使镶嵌在膜脂双层中的抗原流动性增加，并可聚积在液化细胞膜表面，有利于抗体和补体的结合，发挥免疫功能，体外实验证明，42℃2h可使化疗药物的抗癌作用增强10～100倍，43℃联合 aT1258的毒性作用是2者单独作用乘积的218倍，目前高温逆转肿瘤耐药的现象和机理已受到重视（26）。与热疗相对应，有人通过研究小鼠乳腺癌细胞生长的冷敏感性时发现，小鼠乳腺癌 fM3A细胞在低温下（33℃）生长放慢，并且 topoⅡ-α的表达也降低（27）。 　　

6．3基质及营养条件的影响 　　lorico等在研究小鼠淋巴细胞株 wEHI-3B／ nOVO对新生霉素和鬼臼乙叉甙的交叉耐药性时，在培养基中加入能量代谢抑制剂叠氮化物和脱氧葡萄糖时，鬼臼乙叉甙的排除明显受抑制，当重新加入葡萄糖时又恢复了原来的排除率（28），这说明营养条件对耐药性有很大影响。 　　

john等将成年大鼠肝癌细胞分别培养于Ⅰ型胶原、基底膜凝胶、 iV型胶原和层粘蛋白上，然后观察其对化疗药的耐药性，结果表明，细胞外基质对肝细胞的耐药性具有调节作用， i型胶原能使 p-糖蛋白 mRNA表达增加，而基底膜凝胶对其表达无显著影响， iV型胶原和层粘蛋白可降低其表达水平（29）。 　　

6．4氧浓度的影响 　　高氧浓度可激活超氧化物歧化酶，降解自由基，减轻药物的细胞毒作用，如肺部肿瘤由于局部氧浓度高，对阿霉素不敏感，而皮下组织肿瘤由于相对乏氧，则可对阿霉素敏感。 lene-han等曾研究了人 mDR淋巴细胞（ hL-60／ aR）及其亲代敏感细胞（ hL-60），证明 hL-60／ aR细胞 mDR过度表达，抗氧化剂能力较 hL-60增强10倍，抗氧化剂功能增强可以说明其耐某些有氧化作用的药物（如正定霉素）的情况（30）。 　　

细胞生活环境因素对 mDR的影响非常复杂，也很重要，且常在研究中被忽视，因此有人提出变细胞耐药性的提法为组织耐药性（31），以增强研究者的整体观念，并适应人体内生物环境变化的多样性，这方面还有待进一步研究。 　　

总之，肿瘤耐药机制是个非常复杂的问题，由于一些条件和认识水平的限制，还有很多问题没有解决。例如不同肿瘤可能有不同的耐药机理，同一肿瘤在不同的条件下耐药机理也可能不同，多种耐药机制中哪种是主要的，哪种是次要的，相互间的关系如何等，另外，目前还没有统一的 mDR判定标准和检测方法。但尽管如此，肿瘤耐药性的研究无疑使人们对肿瘤的认识又前进了一步，并使肿瘤的治疗呈现出良好的前景。　　参考文献略