结直肠癌早期检测的基因标志物

 　 结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤，在西方发达国家结直肠癌仅次于肺癌列恶性肿瘤的第2位，在我国上海结直肠癌已是第3位常见肿瘤。另外，老年人随着年龄的增高其结直肠癌发病率会不断上升，青年期结直肠癌的发病率也有升高趋势。研究结果显示，结直肠癌的预后与分期密切相关，如0’Connel等报道1991～1999年治疗的2O～40岁的青年直肠癌I、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ期患者，其5年生存率分别为87．9%、75．4%、51．3%、8．0%，6O～80岁的老年直肠癌患者的5年生存率则分别为91．9%、69．8%、52．8%、6．6%。因此早期诊断是提高结直肠癌预后的关键。但是目前结直肠癌的早期检测并不令人满意，所以寻找一种特异性高、敏感性强的结直肠癌早期诊断方法非常必要。癌症的基因标志物检测被认为是目前最有效的预警方式。经过研究，在结直肠癌发生过程中各个阶段存在明显基因改变的累积效应，因此对于这些阶段性基因突变的检测是进行癌症预警的重要方向。现将关于结直肠癌各个阶段的基因标志物研究结果阐述如下。 　　广州医学院附属肿瘤医院胸外科薛兴阳

1 腺瘤性结肠息肉病基因 　　

APC基因于1986年首先由Herrera等发现。已知APC基因位于染色体5q21上，APC基因全长含有一个8 538 bp开放框架，共含有15个外显子，表达产物由2 843个氨基酸残基组成，在很多细胞和组织中表达APC基因突变常见于家族性腺瘤性息肉病，其被认为是结直肠癌发生的早期标志之一。Dihlmann等对500多个家族性多发性腺瘤病(familial adenomatous polyposis，FAP)家族进行APC基因检测，约8O 家族有APC基因突变。对其中176例突变分析，98以上的突变可导致APC蛋白截短，这些突变大多为无义突变(33)、小插入(6)、缺失(55)。在对非FAP结直肠疾病患者的研究发现，35～6O%的患者也出现了APC等位基因缺失。APC基因突变类型主要有点突变和框架移码突变，6O%以上的突变位于第15号外显子，大约95%的结果是在下游形成提前的终止密码子，使APC蛋白呈“截短”改变。密码子第1 286～1 513号之间的1O 左右的编码区集中了约65%的体细胞突变，被称为“突变密集区(mutationcluster region，M CR)。 　　

2 环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)基因 　　

COX一2基因位于第1号染色体1q25．2～25．3，长约8．3kb，其外显子和内含子组成与COX～1相似，含1O个外显子，其mRNA转录产物为4．5 kb，编码一个含604个氨基酸的信号肽。COX是合成前列腺素的限速酶，参与炎症反应，过度表达可以导致多种上皮性肿瘤的发生、发展。最近的研究发现，超过85%的结直肠腺瘤患者发现了COX一2基因的过度表达，同时在70．8%的原发性结直肠癌患者、92．0%淋巴结转移患者和近100%的肝转移患者中均可以检测到COX一2基因的过度表达。COX一2基因的表达还与原发性肿瘤大小、肿瘤的浸润程度、淋巴结转移、甲状腺淋巴结转移阶段和肿瘤的复发有着显著的相关性。 　　

3 K-ras基因 　　

K?ras基因是一种原癌基因，位于染色体12pl2．1上，编码蛋白质由188～189个氨基酸构成，相对分子质量为21 000。K?ras基因的激活能导致肿瘤发生，激活有多种形式，可以是表达增加，或是基因突变，或是内在的GTP酶活性下降，也可以是与GTP及GDP结合的亲和力降低。基因突变往往发生在12、13和61密码子，以12密码子最常见。超过5O%的结直肠腺瘤患者出现K?ras的过表达。经过多年的研究，K?ras基因在结直肠癌中具有高频率的突变，并且突变出现在结直肠癌的早期，可以作为结直肠癌早期检测的标志。 　　

4 p53基因 　　

p53基因是重要的抑癌基因，位于染色体1 7pl3．1上，编码一个由393个氨基酸组成的核磷酸蛋白，有调控细胞的生长、维持基因组稳定的作用。突变的p53基因丧失了调节细胞周期的重要作用，导致肿瘤发生。在早期腺瘤患者、45%有浸润现象发生的腺瘤患者、75％结直肠癌患者中发现了l7号染色体短臂等位缺失l1 。研究人员对结直肠癌患者研究发现 ，17号染色体短臂断裂点位于p53基因位点，同时检测了另一等位基因上p53基因的编码区发现存在突变。这些研究表明p53基因与结直肠癌有很大的相关性。由于17号染色体短臂等位缺失多发生在结直肠癌患者中，而在腺瘤患者中发现较少，所以它被认为是腺瘤发展成为癌瘤的重要标志。 　　

5 l8号染色体长臂缺失 　　

大约1O%的腺瘤患者和75 的结直肠癌患者被发现18号染色体长臂缺失。结肠直肠癌缺失基因(delete incolorectal carcinoma gene，DCC)测序证明位于这个区域上，DCC的氨基酸序列与神经细胞表面受体(NCAM)及其他相关的细胞表面糖蛋白具有同源性，这提示DCC功能的丢失可能导致细胞间接触、黏附能力下降，从而提高癌细胞的转移能力。DCC和p53一样，多在癌瘤患者中发现，所以可以看作是腺瘤恶化的标志。 　　

6 错配修复基因(mismatch repair gene，MMR gene) 　　

MMR基因在体细胞中相当于看家基因，当其发生杂合性缺失后细胞中由于自发性突变增加，最终导致细胞内各种功能下降，特别是各种抑癌基因的失活，最终导致肿瘤的发生。研究 一发现，在遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarv nonpolyposis colorectal cancer，H NPCC)和部分非遗传性结直肠癌即散发性结直肠癌(sporadic colorectal cancer，SRC)发生的早期常常出现MMR基因的突变，从而使肿瘤的发展按照复制错误路径进行。目前研究表明，至少有6个MMR基因与HNPCC 发生有关，包括hMSH2、hMI H1、hPSM1、hPSM2、hMSH6和hMSH3。在这6个基因中，hM?SH2和hMLH1基因突变占所检测到突变的9O 以上。说明这两个基因在HNPCC发生中起主导作用。hMSH2(human mut S homolog 2)是第一个被分离到的人类错配修复基因，该基因与细菌的Mut S 同源，位于2p21～22，其基因DNA 全长约79 kb(不包括启动子)，全长cDNA为3 l11 bp，含有长2 727 bp的开放阅读框架，翻译后编码一种由909个氨基酸组成的蛋白质；hMSH2蛋白在错配修复过程中通过核苷酸聚合酶而起作用，它失活后可引起复制错误的累积，从而引起突变表型；hMSH2在HNPCC中阳性表达约6O%，能够加速腺瘤到癌的转变过程。hMI H1(human mut I homolog 1)是一个与HNPCC发病有关的错配修复基因，是细菌错配修复基因mut L 的同源物，与大约3O%的HNPCC有关 。该基因定位于3p21，hMLH1的cDNA 全长2 484 bp，编码长度为2 268 bp的开读框架。hMI H1蛋白由756个氨基酸残基组成，它常与hMLH3、hPMS2或hPMS1的蛋白组成具有未知的酶活性的二聚体，被认为是一个分子修复标志。 　　

7 小 结 　　

自Fearon和Vogelstein 1990年提出结直肠癌发生的分子模型以来 ，模型中的分子机制不断被充实，研究认为结直肠癌发生过程中基因的改变存在顺序性，这为从基因层面对结直肠癌的预警提供了可行性。目前，直肠结肠癌的分子生物学研究基本处于实验阶段，其主要的原因有两个：其一，结直肠癌缺乏特异性的基因，和结直肠癌相关的基因在其他癌症发生时也都存在改变，尤其是在消化道肿瘤中，如APC和p53在6O%胃癌的患者中也存在突变 ；其二，用于结直肠癌早期检测的方法多为组织化学染色和利用组织为标本的PCR检测，标本均为活检组织，在预警检测中存在标本来源困难的情况。 　　

以上均为结直肠癌早期预警检测的桎梏。因此如何通过基因组合检测提高对结直肠癌的特异性和增加通过血液和粪便检测的覆盖率，将成为结直肠癌早期检测的重要研究方向。