肿瘤靶向给药系统的研究进展

 　 全世界每年约600万人死于恶性肿瘤，中国现有癌症患者约450万人，死亡率逾30％，且每年呈递增趋势。肿瘤的非手术治疗包括放疗和化疗，以杀死肿瘤细胞为目的，但均缺乏对肿瘤细胞的特异性。肿瘤的靶向治疗是将治疗作用选择性地集中在肿瘤组织、肿瘤细胞、肿瘤基因，对正常组织的不良反应可降至最低。 　　

1 以增强的透过及滞留效应和长循环原理为机理的肿瘤组织靶向给药系统 　　广州医学院附属肿瘤医院胸外科薛兴阳

    水溶性高分子聚合物对实体瘤具有倾向性沉积作用，称为增强的透过及滞留效应(EPR efect)。这种现象源于实体瘤丰富的血管及血管的不连续性，使高分子聚合物通过血液循环到达肿瘤部位；肿瘤血管产生的因子(肿瘤血管渗透因子、舒缓激肽、肿瘤坏死因子等)使高分子聚合物通过血管壁到达肿瘤部位；肿瘤部位的淋巴循环较正常组织的透过率低，聚合物通过血液循环进入实体瘤组织，进而进入靶肿瘤细胞。几种聚合物一抗癌药物接合物正应用于临床或进行临床实验，如聚苯乙烯一顺式丁烯二酸聚合物，一新制癌菌素接合物在日本正用于肝癌的治疗，利用长循环原理可以增加药物在肿瘤中的分布。在药物或载体表面连接亲水性聚合物如PEG、聚氧乙烯(PEO)、吐温一8O等，可在体循环中长期滞留而不被单核吞噬细胞系统(MPS)捕获；再通过EPR效应，有效蓄积在实体瘤部位。PEG修饰的阿霉素长循环脂质体(Doxil)因较原药有较好的肿瘤靶向性和较低的不良反应，而成功用于临床。另外，柔红霉素长循环脂质体也已上市。聚合物胶束由于载体材料价廉易得，制备简便，特别适用于脂溶性药物的包裹。以聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺(PEG?PE)制得的胶束，粒径可控制在7?35 rim；长循环半衰期随PEG分子量的增大而延长。在对小细胞肺癌的研究中发现，胶束较脂质体更易通过EPR效应到达肿瘤部位 。 　　

2 肿瘤细胞的靶向给药系统 　　

    肿瘤细胞的靶向治疗是利用肿瘤细胞表面的特异性抗原和受体作为靶点的治疗方法。利用叶酸在药物的肿瘤细胞靶向传递研究中，设计了不少以触发机制释放药物的传递系统，合成具有作用靶点选择活性和无活性细胞毒类药物的前体药物。这些前体药物在触发信号的作用下释放药物。触发信号可以是外源性的(如光、化学物质)，也可是内源性的(如酶)。目前，有不少基于以上科学事实的细胞毒类药物的靶向传递系统正在研究之中 　　

2．1 抗体介导的肿瘤细胞靶向给药系统 　　

    许多抗体对大多数肿瘤如卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等的特异性抗原具有识别作用。重组细胞工程的发展也使肿瘤抗体的低成本工业化生产成为可能。自1975年单克隆抗体首次被发现可以与肿瘤细胞的抗原结合治疗肿瘤后，其研制工作就促进了靶向药物的发展。许多常用抗肿瘤药物被用于制备单克隆抗体一药物的偶联物。单抗的发展主要集中在抗体的人源化、双特异性抗体(通过体外交联或采用基因重组技术将两个特异性不同的抗体分子连接在一起，成为具有两种特异性的新型免疫分子)、偶联物分子的小型化(通过酶切方法得到单抗F(ab )2或Fab片段，Fab片段可穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞)、寻找新的分子靶点(HER一2／neu、Endoglin和基质金属蛋白酶等)和单抗药物的高效化等五个方面。Trastuzumab、Rituximab、Gefitinibl8 等单抗药物已被FDA批准。专家们认为，以单抗药物治疗肿瘤将引领未来的市场，作为抗肿瘤药物的载体亦具有较好的前景。 　　

2．2 受体介导的肿瘤细胞靶向给药系统 　　

    随着对肿瘤分子水平研究的深入，在肿瘤细胞表面或肿瘤相关血管表面发现的系列受体与肿瘤生长增殖密切相关，并在肿瘤组织中过度表达。受体与其配体的结合具有特异性、选择性和饱和性，且亲和力强、生物效应明显。利用配体为药物载体，通过受体的介导作用，增加病灶区的药物浓度，提高疗效，降低不良反应，达到靶向治疗的目的。已发现的3种高亲和力叶酸受体(FR?Ot、FR?B存在于细胞表面的GPI位点，而FR一Ot则在细胞中持续分泌)在肿瘤细胞中过度表达(如卵巢、结肠、乳腺、前列腺、鼻咽、脑等的癌细胞)。作为一种小分子量的配体，叶酸具有非免疫原性、稳定易得、亲和力强、非破坏性的细胞内吞和可化学修饰等优点。叶酸最初用于放射示踪和荧光蛋白等的靶向研究，现已用于放射性药物、磁共振对比剂、小分子化疗药物、蛋白及蛋白毒素、免疫治疗药物、载药脂质体和纳米粒的修饰等。Yoo HS等以叶酸为配体，制备了粒径为100 nm的PLGA?PEG一阿霉素胶束(DOX／FOL)。流式细胞仪和共聚焦显微镜研究结果表明：KB细胞对叶酸所修饰微粒的摄取明显高于无叶酸修饰者，两者的细胞毒性均高于游离药物。裸鼠异位接种KB细胞，DOX／FOL胶束对肿瘤的抑制明显高于PLGA?PEG一阿霉素胶束和游离阿霉素。这可能是由于叶酸介导的内吞作用使胶束更易被癌细胞摄取。为避免将配体连接于聚合物而引起化学性质的改变，或载体聚合物的折叠将配体包裹而降低其与受体的亲和性，特将叶酸连接于可生物降解的聚amidoamine或聚乙烯亚胺为核心的聚谷氨酸分枝聚合物。该聚合物对叶酸受体高度表达的KB细胞表现出明显的亲和性，而对无叶酸受体表达的SK?Br3细胞则无亲和性。已有几种动物肿瘤细胞的叶酸受体水平被确证与人的肿瘤细胞相似，如Balb／c小鼠移植同源性的M109肿瘤细胞、裸鼠移植MDA一231、IGROV或KB肿瘤细胞、C57BIg6小鼠移植24JK肿瘤细胞、DBA小鼠移植L1210A肿瘤细胞等。多种肿瘤细胞膜上胰岛素样受体密度和亲合力增加，并有实验证明胰岛素与多种化合物共价连接后仍具有与胰岛素样受体结合的活性。因此，作为肿瘤细胞主动靶向性给药系统的导向载体，有可能通过受体介导将药物定向转运并导入肿瘤细胞及细胞核内，从而增加抑瘤效果，减少不良反应。文献采用米托蒽醌为抗肿瘤模型药物，以胰岛素为导向载体，制备了米托蒽醌一胰岛素偶联物，并以荷肝癌小鼠为肿瘤模型，研究了基于胰岛素受体高表达的肿瘤细胞主动靶向给药系统的性质。在H荷瘤小鼠体内的分布及动力学的研究表明，偶联物较原药在血液中清除较慢，血浆中AUC是游离药物的7．7倍，tl／zB是原药的3．74倍，并对肿瘤组织具有一定的靶向性。体外药效学评价显示，偶联物较原药进入肿瘤细胞快，进入细胞后所释原药的抑瘤活性无改变，保证了偶联物的主动靶向抑瘤效果；且对正常肝细胞的毒性小于原药，从而确保了正常细胞的较低毒性。人转铁蛋白受体(hTfR)是Ⅱ型膜蛋白，通过结合和内化将血浆中的转铁蛋白(Tf)摄入细胞。文献利用二硬酯酰磷脂(DSPC)、胆固醇(CH)、二硬酯酰乙醇胺一PEG(DsP?PEG)和DSPE?PEG?COOH的混合物，在DSPE?PEG?COOH的羧基末端连接Tf，制备了TL?PEG 一小单室脂质体(100?140 nm)，并进行了体外及Colon26荷瘤小鼠的体内实验，测定其靶向肿瘤细胞的能力。1分子脂质体结合约25分子Tf后，在外周循环的滞留时间达72 h，是PEG一脂质体的3倍，被单核巨噬系统(RES)吞噬的量减少一半，使更多的脂质体靶向进入实体瘤细胞。电镜显示Tf?PEG一脂质体经受体介导的内吞作用进入了肿瘤细胞。说明Tf?PEG一脂质体可作为化疗药或DNA质粒的载体靶向到肿瘤细胞。 　　2．3 前体药物的肿瘤细胞靶向给药系统 　　

    简单前体药物肿瘤细胞靶向给药系统是利用肿瘤中某些酶的水平的升高，活化前体药物，从而释放出具有活性的原药。主要优势在于：不需要抗体和酶作偶联物，但活性原药可由肿瘤部位扩散出去。药物与酶一单克隆抗体连接的偶联物一前体药物也可用于肿瘤细胞的靶向治疗，被称作抗体导向的酶前体药物疗法(ADEPT)。由于使用了酶一单克隆抗体偶联物，此前体药物的靶向分子是肿瘤的相关抗原，并在原位活化，随后释放药物。无活性的前体药物不被细胞摄取，故对正常细胞毒性较小。前体药物通过特异的酶促反应而在肿瘤局部转化为活性药物，并分布到邻近肿瘤细胞，导致细胞死亡。由艾希氏大肠杆菌中分离复制的需氧型硝基还原酶(NTR)正用于ADEPT的研究中。文献将前体药物CB1954的2一、4一位的硝基酶解后，成了一种高活性的交联剂，对NTR转染的细胞活性可提高1×10 倍。Satchi和Duncan在抗体介导的酶前体药物给药系统(ADEPT )的基础上，提出了聚合物介导的酶前体药物给药系统(PDEPT)。给药时，先将羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物一酶(如CathepcinB)接合物注入体内，然后给予具有酶可降解间隔基的HPMA聚合物一抗肿瘤药物接合物。聚合物载带酶及药物到达体内靶部位，酶作用于抗肿瘤药物接合物使药物释放，从而起到抗肿瘤的作用。这不但能够减少系统的免疫原性及非均一性，而且可评价酶及前体药物在体内的分布。以HPMA聚合物一阿霉素接合物为药物模型，HPMA聚合物一组织蛋白酶为酶模型进行研究。组织蛋白酶与聚合物连接后其活性可保持20％一25％。将药物接合物静脉注入B16F10荷瘤小鼠体内，5 h后给予酶接合物，肿瘤部位阿霉素的释放速率明显增加，AUC为单独给予阿霉素接合物的3．6倍。药效学表明，两种接合物联合给药的抑瘤活性(治疗组动物存活时间／对照组动物存活时间)为168％ ，单独给予阿霉素接合物为152％，游离阿霉素为144％。 　2．4 肿瘤血管的靶向给药系统 　　

    肿瘤的生长、侵袭、转移依赖于新生血管的形成。抑制肿瘤介导的血管生成，阻断肿瘤细胞的营养途径，就可有效地抑制肿瘤细胞的增殖。肿瘤血管靶向治疗是利用肿瘤区域新生血管内皮细胞表面的特异性抗原和／或受体起作用。虽然那些针对肿瘤细胞的单克隆抗体的靶向特性在某种程度上提高了局部肿瘤组织内的浓度，但这些大分子物质要达到肿瘤细胞靶区，需要通过血管内皮细胞屏障，这一过程相对缓慢。而血管靶向药物给药后可以先诱导新生血管内皮细胞的凋亡，进而杀灭肿瘤细胞，消除肿瘤。对肿瘤血管靶向制剂的研究主要集中在生长因子受体、内皮因子、针对整合素的肿瘤血管等的靶向药物设计和肿瘤血管血液凝集的诱导治疗等方面。细胞生长因子(VEGF)受体家族和Tie家族属酪氨酸激酶受体家族。VEGF是一种内皮细胞特异性的丝裂源，能在体内诱导血管生成，是作用最强的血管形成因子之一；生血管素(angiopoietin)则是另一作用较强的血管形成因子(包括Ang一1和Ang一2，分子量75 kD，为分泌性蛋白)，其作用是通过内皮细胞特异性的Tie受体家族实现。VEGF受体和Tie受体都具有信号传导所必需的酪氨酸激酶活性，在生理及病理性血管再生中发挥着关键性作用。Janssen APCA等将ATWLPPR多肽序列连接到PEG修饰的脂质体上，使脂质体靶向至肿瘤表面的VEGF受体，以抑制肿瘤血管的生成，体内和体外宴验结果均表现出明显的靶向性。文献 将具有亲水性长链聚乙二醇(PEG)的长循环脂质体(SSL)包裹阿霉素，并将其与VEGF相联，通过VEGF与表达血管内皮生长因子受体(VEGFR)的特异性结合，实现脂质体的定向投放。体外对肿瘤血管内皮细胞的杀伤作用研究结果表明：联有VEGF的阿霉素脂质体可与表达VEGFR的肿瘤血管内皮细胞特异结合，结合率可达非特异性脂质体的2倍。载药的VEGF一脂质体可特异性的杀伤肿瘤血管内皮细胞。48h细胞毒试验表明，联有VEGF的阿霉素脂质体对肿瘤血管内皮细胞的杀伤作用优于无VEGF的阿霉素脂质体(P<0．05)，而对非靶细胞(人血管平滑肌细胞)的杀伤作用两者相当。有研究表明：Tie一2在正常乳腺和少血管的良性肿瘤中缺乏表达，而在乳腺癌中表达显著，尤其在肿瘤周围的新生血管区、肿瘤和炎性细胞浸润的交界区表达最强烈；可使肿瘤血管发芽，促进血管延长和肿瘤血管与供体血管间形成联系；常表达部分对阻断VEGF途径无生物反应的肿瘤，表明Tie一2是部分肿瘤血管化的主要信息途径。内皮因子在小血管和大血管的内皮细胞中高度表达，在有血管生成的组织中特异性高表达，是内皮细胞增殖的相关标记物，为内皮细胞靶向研究提供了新的可能。整合素是跨膜双向信号传导的黏附分子，精确地调控着组织生长、修复、血管生成及肿瘤发生、侵袭等过程。Astrid J Schraa等将RGD共价连接到蛋白质骨架上，制备了多肽一蛋白结合物。从而提高了蛋白质对于 13 整合紊的亲和性。RGD多肽一蛋白接合物可与HUVEC结合。而未连接RGD多肽的蛋白质则未显示任何结合。如将RGD类似物(RGDm)修饰隐形脂质体(sL)，在增加抗肿瘤药物在肿瘤部位蓄积的同时，增加了抗肿瘤药物向肿瘤细胞内的传递。肿瘤血管靶向给药系统的研究仍有存在许多问题。除提高载体载药量、发现新的配体外，有研究提出：此给药系统长期用药的安全性和与用药相关的不良反应，在短期动物实验或临床实验是不能准确反映出来的；临床前研究使用的生长快速的鼠肿瘤或人肿瘤移植瘤为皮下生长的实体瘤，夸大了抗血管生成药物的效果，快速生长的移植瘤新生血管比例相对较高，而临床上不少肿瘤生长缓慢，不成熟血管数相对较低，因此，对药物敏感性不及动物模型；早期疗效的评价与传统的细胞毒性药物不同，抗血管生成药物短期内不能快速显著地消除肿瘤，因此，临床早期评估其效果有一定困难0现在临床上多采用非侵入性医学显像技术，如MRI、多谱勒超声等方法检测肿瘤血管结构和血流变化。 　　

2．5 肿瘤靶向数字治疗的基因给药系统 　　

    据统计，2004年约有l×10 个基因治疗方案应用于临床，其中63．4％用于恶性肿瘤。Osris M等使用PEG对PEI／DNA复合物进行表面修饰，制成49～120nm的纳米粒，再以Tf或表皮生长因子(EGF)配体包衣，可使目的基因在肿瘤组织的表达高于正常组织表达的lO～100倍。文献 将能够阻断内皮信号的一种突变的Raf基因包裹在阳离子纳米粒中，并连接13整合素的配体，观察未连接配体的纳米粒(I)、连接配体的纳米粒(Ⅱ)及连接配体纳米粒伴有过多游离的可溶性配体(Ⅲ)在肿瘤、肺、肝脏和心脏的表达。结果I在肿瘤、肺和心脏中极少表达(<0．5 ng•g 组织)；而II在肿瘤中则显示极高的表达(4 ng•g 组织)，在肺、肝脏和心脏中则无表达；III在任何脏器中均无表达。由此可初步判定，游离可溶性配体能够抢先与肿瘤表面的受体结合，从而阻断连接配体的纳米粒与受体结合。荷瘤小鼠植入瘤株后第9天开始给药，生理盐水对照组、空白纳米粒组和III均不能抑制肿瘤的生长，而II则具有明显的抑瘤效果，6只小鼠中的4只已无法观察到肿瘤的存在，而另2只的肿瘤减小95％，肿瘤血管抑制率达75％。寻找新型的载体材料，合成新的配体，构建转染率高的治疗基因脂质体传递系统；将病毒载体与非病毒传递系统相结合，构建脂质一病毒基因传递系统将成为肿瘤靶向治疗基因给药系统的发展方向。 　　

3 结语 　　

    肿瘤靶向给药系统的研究目前已取得了较大进展，从第一种靶向药物用于临床起，便显示了在肿瘤治疗方面的巨大潜力。但也存在工艺复杂、载药量小、稳定性差，适于临床给药的制剂学以及体内代谢动力学模型和缺乏完整的质量评价和标准等问题。随着分子生物学和分子医学的发展，必将加速从细胞与分子水平对疾病的理解，从而推进肿瘤靶向给药系统的进一步发展。