肿瘤研究的新思路??组织微结构理论和干细胞理论

20世纪后半叶，分子生物学的飞速发展大大深化了人们对生命本质的理解，也把对肿瘤的认识推进到了前所未有的高度。癌基因、抗癌基因、周期相关基因及蛋白质、凋亡相关基因及分子、信号传导系统、转移相关基因、耐药相关基因等研究乃至人类基因组计划的蓬勃开展，使人们从分子水平的不同侧面观察和理解肿瘤成为可能。信息学和网络技术的飞速发展，让人们只需鼠标一点，排山倒海般的文献便尽收眼底。尽管如此，人们对癌症的本质以及如何控制这一恶疾的认识却仍未产生质的飞跃，若干推论仍属假想。对此，被普遍接受的解释是，技术的发展及人们对肿瘤细胞分子突变的理解，还没有达到应有的水平。 广州医学院附属肿瘤医院胸外科薛兴阳
第二种尚不易被接受的解释则是人们的研究方向发生了偏差。正如美国肿瘤学家哈纳汉（D. Hanahan）所讲：“很多人认为本世纪的前几十年，我们对肿瘤发生及治疗的研究仍要沿袭此前几十年的方式，越来越复杂的文献将继续堆积到本已极为复杂的文献堆中，但我们期待着另一种完全不同的研究方式……诚然，这种改变首先依赖于技术的进步，但最根本的改变还有赖于观念的更新。”[1] 尽管他并未说明“观念的更新”指的是什么，但若干研究结论确实已经暗示，过去几十年的研究思路和思维方式可能已经发生了偏差。

由于坚信肿瘤的发生起源于细胞特定基因的改变，肿瘤发生的机理最终必须在基因水平得到解释，对肿瘤的控制最终也必须通过对基因的干预才能实现，过去几十年大多数肿瘤研究都致力于寻找癌细胞基因的突变或表达异常。尽管大规模、高通量的基因分析技术应用日益广泛，但由于肿瘤细胞基因组结构的高度不稳定性，这些基因突变又总是处于时间依赖性、空间依赖性和个体依赖性的变化之中，如何从成千上万的突变中找出真正有意义的、肿瘤共性而又是肿瘤特异性的改变，实际并非易事。每一个新发现带来的惊喜常常伴有随之而来的矛盾和困惑。

爱因斯坦认为，一种理论正确性的重要标志是其逻辑上的简洁性。基因突变理论由于其日益突出的复杂性和不和谐性，在解释肿瘤的成因时已经遇到了不可回避的矛盾。笔者坚信，肿瘤的发生肯定有其具有普遍意义的、能解释肿瘤各种生物现象的简洁的机理，不必用繁杂多变的基因突变来解释，但基因突变又可被纳入其中。重要的是，这种认识隐含着解决肿瘤问题的最佳思路。正如哥白尼如果不提出日心说，人们仍然要在托勒密地心说的统治下费劲地理解天文；爱因斯坦如果不提出相对论，人们仍然要在牛顿经典力学的限制下费劲地理解时空一样，肿瘤学的研究，也已到了必须在观念上发生改变的时候了。

肿瘤发生：基因外因素的重要作用

从1960年代癌基因的发现，到1970年代末发现抗癌基因；从1960年费城染色体的发现，到染色体分带技术进一步提高后，染色体异位和融合基因在白血病、淋巴瘤的发生和分类中认识的深化；从实体瘤中相对特异的基因突变，到大肠癌发生过程中序列基因突变的分析；从基因表达的异常到基因扩增、甲基化等基因修饰的改变，所有这一切无不给人这样的感觉：肿瘤是一种分子病，是基因改变的结果。这一结论也界定了肿瘤学研究的主流，无论是发生机理研究还是治疗，人们无不试图从基因水平寻找答案。

不妨将这种基于基因改变导致肿瘤形成的理论称为基因突变理论。基因改变包括染色体数目的异常和结构的异常（异位、丢失、点突变、扩增和微卫星不稳等）。该理论认为：细胞内系列的基因突变是引发肿瘤的根本原因，因此肿瘤是单克隆的，正常细胞恶变为肿瘤细胞后其后代细胞只能是肿瘤细胞；肿瘤的产生是基于基因水平的细胞增殖和凋亡控制机制的缺陷，特定的基因突变引起了增殖和凋亡这一对矛盾的不平衡，信号传导和周期相关基因、凋亡相关基因的突变是问题的关键；肿瘤细胞几乎所有特点，包括低分化状态、自主性增殖、侵袭转移及多药耐药等，都可归因于特定基因的异常；几乎所有的致癌因素（物理的、化学的、生物的）都作用于特定基因，通过诱发基因突变起作用；控制癌症最有前途的途径是基因干预??修正突变的基因或引入自杀基因。

但是，基因突变理论在解释肿瘤的成因时，的确存在着若干难以回避的矛盾。

肿瘤细胞的基因组表现出极度的不稳定性，随时间和空间的变化而持续地变化[2, 3]。虽然某些基因改变有一定的代表性，如白血病和淋巴瘤中相对特异的染色体异位、K-ras和P53基因的突变等，但同一器官的肿瘤在不同的群体乃至同一群体不同个体中，表现为不同的基因突变谱；同一肿瘤组织内不同的癌细胞，也呈现不同的细胞遗传学和分子遗传学表型[3]。尽管可以把这种不稳定性归因于监控机制的失常，并引入致突基因（mutator）的概念如突变的P53基因[4]，但实体瘤中大多数致突基因实际上存在于肿瘤发生的进展期或晚期阶段。

动物实验表明，畸胎癌细胞向早期动物胚胎移植可以产生发育正常的嵌合型小鼠，说明癌细胞可以参与正常个体的发育。同样，肿瘤细胞向正常成年动物体内移植可以不产生肿瘤，而且发现肿瘤细胞参与了正常器官的构成。对肿瘤细胞的细胞外基质加以干预也可导致肿瘤细胞恶性表型的逆转，而且体内外实验均已表明，通过化学干预可以诱导恶性细胞向正常细胞分化。相反，基因型正常的胚胎干细胞向同系小鼠腹腔移植可产生极度恶性的肿瘤，正常上皮细胞向不正常微环境的移植或改造细胞的微环境，也可导致肿瘤的产生，这些恶性肿瘤可以没有任何的基因改变。而且，恶性细胞几乎所有的“恶性”特点并非肿瘤细胞所特有，正常细胞在个体发育的特定阶段乃至成年后也具备这些特点，它们无需基因突变来解释。

另外，许多有明确致癌作用的理化因素都不是通过作用于基因而发挥作用的，细胞的间质成分是它们作用的靶点。这也难以用基因突变理论来解释。

医学发展的历史表明，对疾病的解释可以通过不同的层次来达到，包括群体、个体、器官、组织、细胞、亚细胞和分子水平。比如感染性疾病可以从器官和组织水平得到解释，线粒体肌病需要在亚细胞水平，而镰刀型贫血却需深入到分子水平。肿瘤的产生实际上是在组织和细胞水平发生了异常，肿瘤的本质是组织结构异常性疾病，基因的变化可能只是一种伴随状况。

从胚胎发育可知，正常组织的发生是一个非常有序的过程。组织内细胞需要增殖到多大程度、向什么方向分化，均取决于细胞与其周围环境不断的信息交流。每一个分化或部分分化的细胞，都通过产生某种信使来诱导或抑制其他细胞的增殖程度与分化方向，同时自身又受到其他细胞或间质结构的影响。也就是说，在“组织形态发生场”（tissue morphogenetic field）里，细胞通过不断的信息交流，逐渐获得其分化状态的形态与功能，以形成和维持完整的组织结构。组织的分化尽管表现为基因的有序表达与关闭，但基因的有序表达与关闭并非自发产生，而是通过细胞与细胞、细胞与环境的信息交流促成。

对于成熟的个体，由于成熟体细胞不间断地衰老和死亡，加之意外的疾病和伤害，都需要组织细胞经常地再生与修复。机体的整体因素和局部因素在维持细胞再生与组织修复中都具有重要的作用。此时，“组织结构场”（tissue organization field）的完整性，仍有赖于细胞与外界微环境间不断的信息交流而实现。如果非生理性的组织损害与细胞丢失反复发生，比如各种慢性炎症，组织持续性损伤与再生的结局往往伴有组织结构的破坏，并产生异常的组织结构如肝硬化、腺上皮萎缩或增生、化生等，因而人们所见的大多数肿瘤都伴有慢性的组织损伤和组织改造。

组织结构的改变为组织内细胞的增殖分化提供了不利的微环境。在异常微环境中，再生的细胞其增殖水平与分化方向仍然要接受外界信息的指令。由于微环境结构的破坏，诱导细胞成熟分化的信号分子可能不再产生，或者产生的量减少，或者信号分子不能到达靶细胞；或因致癌因素的存在干扰了信号传导的关键步骤，从配体灭活、受体封闭到对细胞内信号通路的干扰，此时由于增殖的细胞不能分化成熟，机体有功能的细胞数量减少，这一矛盾的存在使得机体不断地产生刺激性的增殖信号，从而使分化不成熟的细胞持续处于增殖状态。此时，恶性增殖便不可避免。

因此，组织微结构的异常和/或致癌物的存在干扰组织内细胞与其微环境的正常交流，是肿瘤产生的前提之一。这有点类似于索南夏因（C. Sonnenschein）所提出的癌症发生的“组织结构场理论”[5]。它对致癌作用的解释首先强调组织微结构和细胞微环境的改变，细胞外间质成分是各种致癌因素首先作用的靶点，这一改变所引发的细胞与细胞、细胞与间质信号交流的异常，便成了细胞失控性增殖的原因。

重视并重新理解肿瘤组织的低分化状态

肿瘤细胞除了恶性增殖和侵袭转移以外，另一个重要的特点是其低分化状态。无论肿瘤的组织来源如何，肿瘤总表现出低于其对应组织的分化程度，从未分化状态到高分化状态不等。简言之，肿瘤是处于部分分化状态的细胞所形成的组织。

分化和增殖一样，也是肿瘤组织具有普遍性的特点。若干用比较分析技术所获得的肿瘤细胞的差异基因，实际上是肿瘤细胞在特定的分化水平上所对应的分化基因，只是由于它们在正常组织不表达或表达量低，被当成是潜在的癌基因。鉴于肿瘤细胞大多数的恶性特点实际上也为低分化状态的正常细胞所具备，如何正确理解肿瘤细胞的低分化问题，恰恰隐含了对肿瘤本质的理解。

按发育生物学观点，肿瘤的细胞来源只能有两种：成熟分化的细胞去分化（de-differentiation）；机体或组织内本已存在的干细胞在特定的分化水平停止分化或分化失常（dys-differentiation）。

从组织结构和生化特点上，可能由于肿瘤组织与其原发组织的相似性，加上基因突变理论认为肿瘤的本质是体细胞基因突变的结果，人们理所当然地认为，肿瘤细胞就是成熟体细胞在恶变过程中去分化所致。但的确有一些线索使笔者有理由相信，肿瘤可能是来源于干细胞的分化失常，而不是成熟细胞的去分化。

首先，按照基因突变理论，致癌因素作用于靶组织后，敏感细胞通过发生基因改变而获得增殖活性和/或抗凋亡特性，进入正性扩增状态。但理论和经验表明，成熟细胞，比如肝细胞，无需返回低分化状态（即去分化），即可在增殖信号的刺激下进入旺盛的增殖，也无需重新恢复端粒酶活性就足以在其有限的分裂能力内将宿主摧毁，无端粒酶活性的细胞仍可增殖50代。也就是说，如果只考虑基因对增殖和凋亡的影响，恶变细胞无需去分化和获得端粒酶活性。

第二，混合瘤尽管不是很常见，但各种组织和器官中均可见。混合瘤是指肿瘤组织内有一种以上的瘤细胞组分，比如上皮性和间叶性的癌肉瘤。按基因突变理论，不同的瘤细胞是由不同的细胞成分恶变并混合而成，是多克隆的。但最新研究却提示混合瘤大多数也是单克隆的，其不同细胞组分实际上来自于同一个癌祖细胞[6]，是干细胞在异常微环境中差异分化的结果。这种现象难以用去分化来解释。

第三，各种组织和器官的恶性肿瘤都有一个从低分化到高分化的分化系列，即使在同一瘤体内也常常如此，它们实际上是干细胞在不同的分化水平分化受阻的表现。“未分化癌”可以由成熟细胞去分化产生是难以理解的。

第四，胚胎相关抗原是特定细胞在胚胎发育的特定阶段，即组织形成过程中的不成熟阶段，表达的分化抗原。成熟体细胞不表达胚胎相关抗原，而一些组织在恶变后即可恢复表达能力。许多年来这种能力被认为与癌变的发生有关，是细胞恶变后去分化的结果。实际上在许多未发生肝癌的肝硬化病人血清内就有高水平的甲胎蛋白（AFP）表达，肝癌病人的癌周非癌肝组织往往也高表达AFP。这些表达AFP的非癌细胞，同癌组织内表达AFP的癌细胞一样，实际上是发挥代偿性增殖作用的、部分分化的干细胞。不同的是，非癌肝组织内表达AFP的干细胞仍能被它们的微环境诱导分化，而癌组织内表达的AFP干细胞在它们的微环境中分化阻断。癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）和胎儿胃硫糖蛋白可能有类似的情况。

第五，最有代表性的是各种白血病。不同类型的白血病表现为造血干细胞在不同发育阶段的分化阻断，这些白血病细胞在不同分化水平旺盛增殖，用去分化理论也难以理解。同样，对白血病细胞进行化学干预，体外和体内实验均证实它们可以被诱导向成熟分化，分化后特征性标记的染色体消失，异倍体核型也趋向于向正常核型转化，而且分化过程中出现过渡态，即在形态上介于幼稚和成熟之间，在细胞表面标志上表现为既有幼稚细胞分化抗原，又有成熟细胞分化抗原，而诱导分化完成后只表达成熟细胞分化抗原。

第六，目前日渐深入的干细胞研究表明，成年个体体内存在具有多向分化潜能的干细胞[7, 8, 9]。在慢性病理状态下，微环境由于组织结构的破坏和改造（如慢性炎症），加之致癌物的作用而使诱导作用未能发生，干细胞便可能阻断在某一特定的分化状态。由于未成熟分化的细胞不能行使正常的功能，机体在器官功能不足的情况下持续地发出强增殖信号，部分分化的干细胞便持续增殖，此时癌实际上已经产生了。

部分分化的干细胞克隆可以模拟正常的组织结构（高分化），也可形成异常分化的杂乱的组织结构（低分化），这取决于干细胞受阻于哪一个分化状态。但它们具有以下共同特点。

细胞具有和正常干细胞相似的细胞表面标志和生化特点；高速增殖和端粒酶阳性；增殖的同时可诱导血管形成。重要的是，血管生成细胞本身也可能来自干细胞，此时肿瘤细胞便成为诱导者。在肿瘤的形成过程中，肿瘤干细胞本身也可参与血管壁的构成[10]。

在微环境对增殖不利的情况下，如缺氧、代谢物中毒等，干细胞可发生自身凋亡，临床上表现为恶性组织极高的凋亡水平，但总体凋亡水平低于增殖水平。由于增殖速度过快，其基因组结构趋于不稳。肿瘤干细胞所具备的吞噬能力也可能使肿瘤细胞获得额外的染色体。核型的异常或染色体微结构的突变便可能产生。结局有二：一是引发自身凋亡，二是进一步获得自主性的克隆优势，此时在不依赖于生长因子的作用下，也可表现出旺盛的增殖能力和侵袭转移能力。

在正常血液和淋巴系统，造血干细胞需要在特定的分化水平发生染色体结构的重排和异位，如果致癌作用发生在这个分化水平，那么恶性增殖的血液细胞便会带上特征性的标志染色体，但这种细胞被诱导分化后，特征性染色体应消失。

被部分诱导分化的干细胞如果尚未参与组织发生，细胞表面粘附分子的低表达使其处于相对的自由状态，更易于通过淋巴液和血液播散。

能在远处转移生长的干细胞仍维持其部分分化状态，具有相似于其来源组织的结构和生化标志。但是否能在转移的靶组织生长仍有赖于环境信号分子的特异性选择，即是否“安家”有赖于靶器官微环境的特异性识别，是有选择的。

总之，从正常组织的发生、发育和分化过程来看，肿瘤的产生实际上就是体内原已存在的干细胞未成熟分化的过程。其重要前提是组织微环境结构的破坏或改造，成熟细胞的可替代性增殖受到抑制，加之各种致癌物的作用使诱导信号受到干扰，干细胞的不成熟分化便成为可能。肿瘤细胞所具有的大多数恶性特点，实际上也是干细胞在未成熟分化时所具有的特点。核型改变和基因突变可能是肿瘤产生过程中的伴随现象。一个癌组织分化状态的实质，是其内含的不同分化程度的干细胞所占比例的外在表现。高分化形态是由于大多数干细胞已经历了一定程度的分化；而低分化形态则是由于干细胞及其部分分化的子细胞与已分化成分相比，占了显著地位的缘故。

清除杀灭抑或诱导分化

人类同癌症作斗争的历史可追溯到两千多年以前。近一两百年来，随着外科手术的逐渐发展，尤其是近几十年显微外科、微创外科、移植外科的发展，肿瘤外科从理论到实践日益成熟。放射治疗也有一百多年的历史，随着计算机技术的发展，放疗技术发展到了三维显示、立体定向和超分割放疗。半个世纪前，肿瘤化疗药物的应用和发展使肿瘤的全身治疗成为可能，病人的生存期明显延长，部分白血病、淋巴瘤及绒癌等实体瘤得以治愈。代表着当代肿瘤治疗主流的这三大传统方法，以及后来建立的免疫治疗、基因治疗、血管生成抑制剂治疗、介入治疗和造血干细胞移植支持化疗等，都有一个共同的指导思想：肿瘤组织和肿瘤细胞必须被最大限度地清除或杀灭。

然而由于肿瘤细胞本身的特点，这一指导思想的局限性也是显而易见的：不彻底性，且不说强调局部的手术和放疗，就是强调整体的化疗也难以将肿瘤细胞和其转移灶完全杀灭；严重的副伤害，在杀死肿瘤细胞的同时，机体有功能的正常增殖细胞群也受到严重伤害，更不用说一些毁容性和致残性的手术了；复发问题，化疗耐药导致癌细胞残留是一个方面，但在致癌因素的持续作用下，新发癌灶也可随时出现，比如原发性肝细胞癌；新发展的技术似乎也难以摆脱这样的矛盾。原因很简单，肿瘤抗原的特异性并不足够高；肿瘤干细胞往往是胚胎发生的特定阶段曾出现过的成分，因此人体与生俱来就对肿瘤细胞产生了耐受；每一个人们所设想的肿瘤特异性靶点在正常组织均有存在，而且在必须的时候需要行使其功能。

产生这种局限性的原因也很简单。由于肿瘤细胞内杂乱的染色体核型和诸多的基因突变，加之基因转染技术可使非肿瘤细胞向恶性细胞转化，人们理所当然地认为肿瘤的本质是基因的异常，只有通过清除或杀灭瘤细胞才能实现治疗的目的。如果肿瘤的本质并不是基因的变异，把现象当成本质理解的结果，一方面使人们继续加大无意义的投入，一方面却又面对肿瘤细胞极多的基因突变陷入宿命论的泥潭。

既然癌可以起源于干细胞的非正常分化，那么设法通过改变微环境，诱导或“操纵”癌细胞向正常细胞分化，完全可以成为癌症治疗的立足点和希望之所在。早在1970年代，伊尔门西（K. Illmensee）就发现将畸胎癌细胞移植至正常同系动物的胚泡内，结果产生不长肿瘤的嵌合型小鼠。1980年代韦布（C. G. Webb）将白血病细胞向同系动物的早期胚胎移植，发现白血病细胞可参与正常动物血液系统的发育，动物发育成熟后各系血液细胞均可发现白血病细胞的基因标记。1990年代科尔曼（W. B. Coleman）将肝癌细胞向同系成年动物肝组织移植，发现癌细胞可参与正常肝脏的细胞更新；同样，通过改造细胞外基质微环境，乳腺癌细胞可以发生恶性表型的逆转。20世纪末体外和体内研究均已证实，维甲类化合物对人类白血病具有良好的分化诱导作用。对于实体瘤的诱导分化研究，也已积累了许多实验室及临床经验，证实肿瘤细胞是可以通过环境干预而被诱导分化的[11]。

目前的诱导分化研究大多是对肿瘤细胞进行化学干预。能产生诱导分化作用的化学物质包括维甲类化合物、二甲基亚砜、维生素D及丁酸等。有些在体外有明显诱导分化作用的物质因对人体有较大的毒性而限制了其应用。此外，诱导后复发及诱导物反复使用后产生耐受也是需要进一步探讨的问题，如何寻找高效低毒的化学诱导物将是今后研究的方向。

另一个尚未涉足的领域是寻找正常组织内具有诱导干细胞分化功能的物质。正常组织结构的维持有赖于机体严格的时空调控，肝组织的再生、骨折的愈合、创面的修复等，都是极好的例子。可能存在的组织形态维持分子（morphostats）[12]，对肿瘤干细胞的增殖和分化应具有指令性作用。

最有潜力的诱导分化物可能会来自胚胎组织。在胚胎的组织发育过程中，决定细胞增殖程度和分化方向的组织形态发生分子（morphogens）[12]，对于肿瘤细胞可产生明显的、向正常细胞转化的作用。这在动物实验中已得到证实，人体特定的胚胎组织提取物对一些晚期恶性肿瘤也表现出良好的效果。在后基因组时代，随着蛋白质组学和蛋白质芯片技术的深入研究，可能会为人们寻找胚胎组织的组织形态发育场和成体组织的组织结构场中有特定诱导分化作用的分子，提供极大的可能和便利。

人类已经步入21世纪。医学界公认，肿瘤研究的最根本目的是降低发病率和死亡率。但站在广大群众的立场上，这个目的必须有一个前提??在减轻身心痛苦的同时，必须大大降低巨额的医疗成本。这有赖于人们对癌症的认识实现一个质的飞跃。无论现在人们所谈论的癌症成因多么复杂，在它的背后肯定有一个最普遍意义的机制，使癌症发生的复杂的生物性、理化性和遗传性因素都殊途同归，达到认识上的统一，并在这一机制的指导下实现癌症治疗的飞跃。

癌症研究的观念必须更新，对癌症的认识必须从一个新的视角去把握。组织微结构理论和干细胞理论的结合，为癌症的产生提出了合乎逻辑的解释，也为诱导分化理论的深入研究提供了依据，相信对这一领域的深入研究将使人们看到癌症治疗的曙光。我们的理想正如哈纳汉所说：癌生物学和癌症治疗的研究今天还是一个杂合了细胞生物学、遗传学、组织病理学、生物化学、免疫学和药物学的百衲衣。我们期望有一天，它将变成具有完整的观念结构和逻辑连贯的、可与当代化学和物理学相媲美的完美的科学[1]。