百草枯染毒大鼠组织毒物含量与脏器损伤的关系研究

山东大学齐鲁医院中毒与职业病科，济南 250012

赵波，菅向东，张忠臣，郭辉，王忠伟，刘峰 

[摘要] 目的  观察百草枯染毒大鼠模型中百草枯在血浆和脏器组织中含量的动态变化，探讨百草枯染毒大鼠组织毒物含量与脏器损伤之间的关系。方法  90只成年健康雄性Wistar 大鼠随机分为对照组和染毒组。观察染毒后不同时间点百草枯在血浆和脏器组织中的动态变化，同时留取肺、肾、肝、心、脑组织做病理学检查和肺组织羟脯氨酸测定。结果 百草枯染毒后不同时间其在血、肺、肾、肝、心、脑分布及含量有明显差别,在肺、肾中较高，在脑组织中较低但存在时间较长。染毒大鼠各脏器损伤病理变化不同，以肺组织损伤最为严重，脑组织损伤最小；肾、肝、心组织损伤有逐步恢复趋势，而肺组织损伤逐渐加重。肺组织羟脯氨酸含量也逐渐增高。结论 百草枯染毒大鼠不同组织在不同时间点其毒物含量不同，百草枯在组织内含量越高，其损伤就越重。百草枯在肺内完全消除后，肺损伤仍可继续发展。山东大学齐鲁医院中毒与职业病科菅向东

[关键词] 百草枯；中毒；高效液相色谱法；肺纤维化

Empirical study on relationship between paraquat tissue content and organ injury in paraquat poisoning rat

ZHAO Bo,JIAN Xiang-dong,ZHANG Zhong-chen,GUO Hui,WANG Zhong-wei,LIU Feng,KONG Xiang-lin,GUO Rui-chen.Department of Occupational Diseases,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China

Corresponding author:JIAN Xiang-dong(E-mail:[e-mail])

　【Abstract】　Objective　To observe the content dynamic changes of paraquat in plasma and tissue in the paraquat poisoning rat model and explore the relationship between paraquat tissue content and organ injury.Methods  All 90 adult healthy  male Wistar rats were randomizedly divided into control group and paraquat poisoning groups. Paraquat in plasma and tissue were determined at different time points and at the same time the tissue of lung, kidney, liver, heart, brain were retained for pathological examination.The hydroxyproline of lung tissue was also determined. Results  Distribution and content of paraquat in plasma,lung,liver, kidney, heart and brain are differences. The content of paraquat in lung and kidney is higher and the content of paraquat in the brain is lowest,but it exist for longest time.The pathological changes are difference in different organic tissues.Lung tissue injury is most serious and brain tissue injury is the lightest.The injury of kidney, liver,heart were gradually restored,but the lung injury was gradually aggravate and the content of lung hydroxyproline was increased at the same time.

Conclusion There were relationship between paraquat content and organ injury in

paraquat poisoning rat model.The more content of paraquat in the tissue ,the more injury occured. The lung injury continue to develop after paraquat was completely eliminated in the rats.

[key words] Paraquat；Poisoning；High performance liquid chromatography(HPLC)；Pulmonary fibrosis

 

百草枯( Paraquat，PQ )又名克芜踪, 化学名称为1, 1′-二甲基-4, 4′-联吡啶二氯化物，分子量257. 2, 分子式：C₁₂H₁₄N₂?2Cl ，为有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂,对人畜有较强的毒性,可经皮肤、呼吸道、消化道吸收造成急性中毒，由于目前尚无特效解毒剂，百草枯中毒后死亡率很高，其实际危害程度已超过了有机磷农药和毒鼠强等剧毒灭鼠剂，然而其发病机制尚不清楚[1，2]。本实验利用高效液相色谱法（HPLC）检测百草枯染毒Wistar大鼠血浆和主要脏器组织中毒物含量的动态变化，探讨脏器组织百草枯含量动态变化与脏器损伤之间的关系，为临床治疗提供理论依据。

 

材料与方法

    1. 实验动物及材料

成年健康SPF级雄性Wistar大鼠90只，山东大学实验动物中心提供，证书号：SCXK(鲁)20030004，体重在240～260g。体积分数为20%的百草枯溶液由江苏先正达南通作物保护有限公司生产。

2. 动物模型制备  将上述大鼠饲养观察一周后，随机分为染毒组和对照组，每组10只。染毒组给予50mg/kg百草枯原液（20%）加蒸馏水稀释至1ml灌胃染毒,对照组同时给予1ml蒸馏水灌胃；染毒组分别与染毒后8h、24h、48h、3d 、7d、14d、21d、28d处死，对照组于实验结束后一并处死。实验期间严密观察并记录各组动物表现。

3. 动物处理及标本采集  各组动物均于观察结束后，采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物,采用下腔静脉穿刺取血约5ml,取血后处死动物,血液中加入适量肝素抗凝并静置30分钟,离心后留取血浆,-70℃冻存,待检测。死亡动物于呼吸停止前采血。留取左肺、左肾、心脏、肝脏、脑组织，-70℃冻存,待做组织百草枯含量检测；留取右肺、右肾、心脏、肝脏、脑组织做病理学检查，置于质量体积分数为10%的甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋，组织切片,苏木精－伊红(HE)染色及Masson染色,光学显微镜观察；同时留取右肺组织约100mg，-70℃冻存,待做肺组织羟脯氨酸测定。

4. 百草枯组织含量检测

4.1试剂及仪器

试剂  百草枯标准品100mg（Sigma公司，美国）；磷酸，分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，美国J.T.Baker公司，批号LOTC28829；三乙胺，色谱纯，美国TEDIA公司，批号LOT601048；庚烷磺酸钠，J.T.Baker公司，批号LOTB13662。

主要仪器  Waters515高效液相色谱仪，2487紫外检测器，717自动进样器（美国沃斯特公司）。XW-80A型漩涡混合器（上海精科实业有限公司）；PK514BP超声清洗器（德国BANDEL）；梅特勒－托利多AX-205Delta Range电子天平（瑞士梅特勒公司）；T25 basic匀浆机（IKA Works GUANGZHOU）等。

4.2标准溶液配制  精确称取百草枯10mg于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度得浓度为1.0mg/ml浓标液。浓标液储存于4ºC冰箱，工作液在使用前由浓标液逐级稀释制得。

4.3仪器分析条件色谱条件  钻石C18 250mm×4.6mm，5µm色谱柱；流动相：乙腈：75mmol/L庚烷磺酸钠（12：88:三乙胺调PH＝3.0，V/V）：流速为1.0ml/min；检测波长为258nm；柱温为室温。

4.4组织匀浆处理  称取适量肺、肝、肾、心、脑组织, 在冷生理盐水中漂洗，除去血液与杂质，滤纸拭干并精确称重，放入塑料匀浆试管中,加入2ml冷生理盐水, 用剪刀剪碎组织块。用组织匀浆机（13 500r/min）电动匀浆，匀浆时间30秒/次，间隙10秒，连续3次，制备组织匀浆。 将制备好的匀浆用低温低速离心机3 000r/min离心10分钟,将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。

4.5样品处理  分别吸取血浆、组织匀浆上清液0.5ml置于试管中，加入35％高氯酸100µl,蜗旋1分钟,高速离心5分钟，取上清液20µl进样进行HPLC分析，记录实验数据。

4.6 建立标准曲线  精确配制百草枯质量浓度20、50、100、500、1 000、5 000ng/ml范围内的6个空白对照血浆样品及不同组织空白对照匀浆样品,在本色谱条件下，按样品处理方法处理后,测其峰面积,由百草枯峰面积Y对百草枯质量浓度X进行线性回归,得百草枯样品的回归方程。百草枯在20～5 000ng/ml范围内线性关系良好，百草枯最低检测线为20ng/ml。

血浆百草枯回归方程：  Y=829.257061X+1358.5677   R=0.99862；肺组织百草枯回归方程：Y=677.320174X+79.5139   R=0.99853；肾组织百草枯回归方程：Y=680.367597X+216.8824    R=0.99842；肝组织百草枯回归方程：Y=719.9229886X-949.6264  R=0.99953。

4.7 计算数据

依据百草枯回归方程可得血浆和各组织匀浆中的百草枯浓度(ng/ml)，然后计算各组织中百草枯含量,计算公式：百草枯含量(ng/g)＝

5. 肺组织羟脯氨酸测定

 羟脯氨酸试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，取冻存肺组织在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干，精确称取肺组织湿重50～100mg，采用样本碱水解法，按说明书方法进行测定。

6. 统计学方法  采用SPSS 13.0统计软件，数据用平均数±标准差（ ±s）表示，数据的比较采用两组独立样本的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

 

结  果

1. 各组大鼠一般情况变化

   百草枯染毒各组大鼠在7天内，蜷缩少动，不同程度的耸毛，反应迟缓，饮食量减少，体重下降明显,呼吸喘促，部分大鼠有口鼻及眼角出血；7～14天各组大鼠体重不再继续下降，活动增多，毛发较前光整，呼吸渐趋平稳，饮食量增加；14～28天，各组大鼠体重有所增加，精神较前好转，但整体改善情况不一。对照组饮食正常，反映灵敏，活动敏捷，毛发光泽，呼吸平稳。

2. 百草枯在各组大鼠血浆和组织的含量

表1.各组血浆和肺组织中百草枯含量的比较（ ±s）