乙双吗啉处理小鼠白细胞DNA-加合物水平变化的研究

中国职业医学2007年8月第34卷第4期

乙双吗啉处理小鼠白细胞DNA-加合物水平变化的研究

菅向东¹，阚宝甜¹，楚中华¹，郭广冉¹，张海艇²，王灏²，张政伟¹ ，阮艳君¹，林大伟¹

 山东大学齐鲁医院中毒与职业病科菅向东

摘要  目的 研究乙双吗啉处理小鼠白细胞DNA-加合物水平的变化规律。方法 整体动物实验：① 整体动物实验方法：纯系615小鼠80只随机分为乙双吗啉1、2和4mg剂量处理组及对照组，处理组给予相应剂量乙双吗啉灌胃，每日1次，连续2个月，对照组同时给予等量蒸馏水，观察处理不同时间小鼠外周血象及骨髓象的变化;② 外周血白细胞DNA的提取及定量;③ DNA-加合物的测定; ④ 外周血白细胞微核率的测定和骨髓染色体畸变率测定。离体实验方法：① 离体实验体系的建立; ② 外周血白细胞DNA的提取及定量; ③ DNA-加合物测定。结果 ① 整体动物实验：乙双吗啉处理小鼠白血病发病率明显增高，其发病率分别为：1mg组15%，2mg组25%，4mg组25%，与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），处理组白血病小鼠总体发病率为21.7%；乙双吗啉处理小鼠外周血白细胞DNA-加合物较对照组升高（P<0.01）；乙双吗啉处理小鼠外周血白细胞微核率和骨髓染色体畸变率较对照组升高（P<0.01）。② 离体实验：乙双吗啉可使小鼠白细胞DNA-加合物升高，与对照组比差异有非常显著性（P<0.01）。结论 乙双吗啉可诱发小鼠白细胞DNA-加合物水平升高。

关键词：DNA-加合物;乙双吗啉;小鼠

中图分类号：R135.1文献标识码：A

 

Study of change of DNA-adducts level of white blood cell in mouse treated by bimolane

Xiang-dong JIAN, Bao-tian KAN, Zhong-hua CHU,et al

(Shandong University Qilu hospital,Jinan 250012 ,China)

Abstract: Objective To observer the changes of white blood cells DNA-adduct level of mouse treated by bimolane. Methods This study included in vivo experiment and in vitro test two parts. The in vivo experiments included four parts:⑴Preparation for animal model；⑵ Extraction and quantitation of DNA from peripheral blood leucocyte of mouse;⑶ Determination of DNA-adducts;⑷ Determination of peripheral blood leucocyte micronuclear rates and bone marrow chromosomal aberration rates; The vitro test included three parts:(1) The establishment of treatment system in vitro;(2) Extraction and quantitation of DNA from peripheral blood leucocyte of mouse;⑶ Determination of DNA-adducts. Results (1)The leucemia morbility rates of mouse treated by bimolane were highly increased and had significantly difference when compared with control groups (P<0.01);(2)The DNA-adducts of peripheral blood leucocyte mouse were highly increased treated by bimolane and had significant difference when compared with control groups;(3)The peripheral blood leucocyte micronuclear rates and bone marrow chromosomal aberration rates in treated mouse was highly increased by bimolane and had significant difference when compared with control groups( P<0.01 ).(4) The

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基金项目：山东省卫生厅计划项目（项目编号1996CAICJB5）

作者单位：1.山东大学齐鲁医院，山东济南 250012；2.山东大学医学院，济南 250012

作者简介：菅向东（1967-），男，内科学博士，教授，硕士研究生导师，主要从事中毒与职业病、风湿病临床工作，Email:[e-mail]

DNA-adducts of peripheral blood leucocyte in mouse treated by bimolane was highly increased by bimolane and had significant difference when compared with control groups in vitro. Conclusion It was suggested that bimolane could induce the increase of DNA-adduct level of mouse.

Keywords: bimolane; DNA adducts; mouse

 

DNA-加合物是由化学物质与DNA形成共价结合的产物，是近年来备受关注的一种生物大分子的重要遗传损害^[1-4]，它的形成可影响基因的表达，破环染色体的正常结构，在DNA复制过程中必然造成某些重要遗传信息的改变和丢失，从而诱发突变及肿瘤的发生^[5-7]。本研究以乙双吗啉为研究工具，对DNA-加合物与化学因素相关性白血病发生、发展的之间的关系进行的研究。

 

1 材料和方法

1.1 材料

1．1．1 动物 615 纯系小鼠，SPF级，购于中国医学科学院血液病研究所动物实验室，雌雄各半，9周龄，体重18～21g。

1．1．2 试剂 乙双吗啉，辽宁抚顺市化工研究设计院化工实验厂提供，纯度>99%，[γ-³²P]ATP(222GBp/μmol),美国Dupont公司产品，Na¹²⁵I购与中国原子能科学研究院，放射性强度为 6290 Bq /L，PEI-Cellulose薄层层析板，德国Brinkman公司产品。其他试剂包括RNase AA,蛋白酶K,牛脾磷酸二酯酶，微球菌内切酶，核酸酶P1，T4多聚核苷酸激酶，N,N-二(羟乙基)甘氨酸, 亚精胺 , 二硫苏糖醇, 羟乙基哌嗪乙磺酸，RPMI1640，小牛血清，青霉素，链霉素，植物血球凝集素，碳酸氢钠，羟基脲，二甲基亚砜，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，乙酸，乙二胺四乙酸，氚-胸腺嘧啶核苷，硫氰酸钠，脱氧核糖核酸，三氯醋酸，过氯酸，无水乙醇，甲苯闪烁液。

1．1．3主要仪器 超速冰冻离心机，Eppendorf公司产品，紫外分光光度计，Beckman公司产品，LS6000SE液体闪烁计数仪，Beckman公司产品，液闪杯，Sigma公司产品。

1.2方法

1.2.1 整体动物实验

1.2.1.1动物处理及观察方法 选取615纯系小鼠80只，随机分为1、2 和4mg不同剂量乙双吗啉处理组及对照组,每组20只小鼠，雌雄各半。处理方法为将不同剂量乙双吗啉用蒸馏水稀释，制成0.5ml混悬液，每日1次灌胃，对照组同时给予等量蒸馏水，连续处理2个月后停止处理观察饲养，第3～5个月每个月检查1次外周血象，从第6个月开始每半个月检查1次外周血象，有白血病表现征象者密切观察，每周称体重1次，有不能进食、精神不振者立即活杀，取血、骨髓等组织置液氮灌内保留。所有动物均于处理9个月后处死，取血及骨髓等组织与以前保留组织一起进行DNA-加合物、染色体畸变率、微核率测定，同时观察外周血象及骨髓象变化。

1.2.1.2 DNA-加合物的测定 取小鼠抗凝血1ml混匀，离心后弃上清，以TEN缓冲液悬浮血细胞，加入10%SDS（终浓度为0.5%）及蛋白酶K（终浓度为150mg/L ），50℃水浴3h,等体积饱和酚-氯仿异戊醇溶液反复抽提，上清液中加入95%冰乙醇，颠倒混匀，可见白色丝状DNA沉淀，以适当体积酚-氯仿异戊醇溶液溶解DNA,紫外分光光度计上对DNA溶液定量。以0.1U牛脾磷酸二酯酶及0.6U微球菌内切酶水解10μg DNA后向溶液中加入核酸酶P125U，37℃水浴4h。[γ-³²P]ATP740kBp进行标记。PEI-Cellulose薄层层析板上点样并进行5相层析。-80℃放射自显影3d，取加合物斑点用液体闪烁仪进行定量。

1.2.1.3 骨髓染色体畸变率测定 取一侧股骨用RPMI1640液4ml冲洗股骨髓并置于离心管中，离心，弃上清液，加新配置固定液（甲醇3份:冰醋酸1份），固定20min，离心，再重复固定1次，固定后放冰箱过液、制片，后用吉姆萨染液，油镜计数100个中期细胞。

1.2.1.4 微核率的测定 取外周血1ml置有肝素的离心管中混匀，再加0.5ml 96甲基纤维素1ml混匀，置37℃培养30min，吸取上清液及白细胞层，离心，弃上清液，留0.5ml混匀成细胞悬液，涂片吉姆萨染色，油镜计数1 000个细胞，计算细胞微核率。

1.2.2离体实验

取健康615纯系小鼠血白细胞以4×10⁶细胞数作为一个样本，8个样本为一组，接种于100mm玻璃平皿上，在10%小牛血清的DMEM，5%CO₂,37℃的环境中培养40h,再以SGM（HEPES 50mmol/L pH 7.2,氯化钠100 mmol/L ,氯化钾5 mmol/L ,氯化钙 2 mmol/L ,葡萄糖5 mmol/L ）10ml换液，然后加入乙双吗啉-二甲基亚砜混悬液，使其终浓度为0、10、20、40、80μmol/L,再培养5h。然后将细胞及液体移置离心管中，磷酸缓冲液冲洗，3 000r/min 离心5 min离心后弃上清，以TEN缓冲液悬浮血细胞，加入10%SDS（终浓度为0.5%）及蛋白酶K（终浓度为150mg/L），50℃水浴3h。等体积饱和酚-氯仿异戊醇溶液反复抽提。上清液中加入95%冰乙醇，颠倒混匀，可见白色丝状DNA沉淀，以适当体积酚-氯仿异戊醇溶液溶解DNA,紫外分光光度计上对DNA溶液定量。以0.1U牛脾磷酸二酯酶及0.6U微球菌内切酶水解10μgDNA后向溶液中加入核酸酶P125U，37℃水浴4h。[γ-³²P]ATP740kBp进行标记。PEI-Cellulose薄层层析板上点样并进行5相层析。-80℃放射自显影3d，取加合物斑点用液体闪烁仪进行定量。

1.3 统计学分析 采用SSPS11.5软件做统计学分析，分别采用 χ² 检验和 t 检验。

 

2 结果

2.1整体动物实验

结果见表1。乙双吗啉处理小鼠白血病发病率明显增高，其发病率分别为1mg组15%，2mg组25%，4mg组25%，与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01），处理组白血病小鼠总体发病率为21.7%。乙双吗啉小鼠骨髓染色体畸变率和微核率较对照组明显升高，差异有非常显著性（P<0.01）。乙双吗啉处理可使小鼠外周血白细胞DNA-加合物明显增加，与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01）。

2.2离体实验

结果见表3，乙双吗啉在离体可使小鼠外周血白细胞DNA-加合物含量明显增加，与对照组相比差异有非常显著性（P<0.01）。

 

 

 

表1 乙双吗啉处理小鼠白血病发病及骨髓染色体畸变率和微核率的变化

组别 动物数（只） 白血病小鼠数（只） 白血病发生率（%） 染色体畸变率（%）微核率（‰）         

1mg组  20           3              15**              2.26**             3.54**

2mg组  20           5              25**              3.84**             6.88**

4mg组  20           5              25**              5.60**             9.66**

对照组 20            0              0                 0.86              1.08  

与对照组比较，**P<0.01

 

 

 

 

 

表2 乙双吗啉处理整体和离体实验小鼠白细胞DNA-加合物测定

组别    n    DNA-加合物（CPM/μgDNA）整体	组别  n  DNA-加合物（CPM/μgDNA）离体
1mg组  20      152.16±35.24** 2mg组  20      247.56±55.68** 4mg组  20      522.16±47.78** 对照组  20      78.64±39.25	10μmol/L组  8      52.61±25.74** 20μmol/L组  8      81.31±31.45.** 40μmol/L组  8      134.58±42.94** 80μmol/L组  8      203.87±54.62 对照组        8      26.35±19.80

与对照组比较，**P<0.01

 

3  讨论

研究化学因素相关性白血病的发病机制，寻找其早期诊断的敏感指标，不仅具有重大的理论意义，也是当前临床毒理学、药理学及肿瘤治疗学发展迫切需要解决的问题。

1982年我国首次合成抗肿瘤药乙双吗啉并迅速广泛应用于临床，随后陆续发现它具有很强的致白血病作用，短短30余年，与乙双吗啉相关的白血病病例报道已达数百例，我们在以往研究的基础上成功制备了乙双吗啉相关性白血病动物模型。

近年来，大量的肿瘤流行病学调查表明，毒性化学物质与细胞DNA相互作用形成共价加合物则被认为是化学致癌过程启动的关键^[8-10]。目前认为外源性化学物与DNA发生共价结合，形成的加合物一旦逃避自身的修复，就可能导致某些特异位点的基因突变，因此DNA加合物的形成被认为是致肿瘤过程中的一个重要阶段，它可以作为接触生物标志物来反映毒物到达靶部位的内接触剂量。我们本次研究结果表明，乙双吗啉在体内和离体均可与小鼠白细胞中的DNA形成共价加合物，在一定剂量范围内具有明显的剂量-效应关系。DNA-加合物形成后，如果自身修复系统不能够及时的识别和修复，可直接影响DNA的复制，造成遗传信息的改变，从而导致基因突变，可诱发白血病。

乙双吗啉是丙亚胺类药物，与丙亚胺、乙亚胺有着相似的药理作用，它是中国科学院上海药物研究所70年代设计合成的，于1979年临床试用，1982年正式用于临床。细胞动力学研究表明，该药有阻滞DNA合成的作用，用于治疗淋巴瘤、肺癌及胃癌等。由于对银屑病治疗效果极佳，且其价格便宜，倍受银屑病人及基层医院欢迎，在皮肤科应用较多。当该药开始在临床应用时人们认为它几乎无不良反应，但随着应用的广泛及用药时间的延长，人们逐渐发现它能使有些用药者发生药物相关性白血病，当乙双吗啉治疗后出现白血病时，曾有人认为是一种偶然的巧合或认为银屑病与白血病的发生都与病人的免疫缺陷有关，两者是同一个病因。对随着研究的深入，人们发现乙双吗啉还有致畸作用，乙双吗啉与白血病有相关关系，且白血病的类型绝大多数为急非淋，同时研究也发现银屑病病人白血病的发病率与一般人群差异无显著性 ^[11-13]。已有实验证明乙双吗啉具有强诱变性，作用于紫露草的细胞染色体和纺锤体，使染色体发生畸变，纺锤体断裂，由此可认为乙双吗啉诱发白血病的机制是作为一种染色体毒物，引起人体染色体畸变而致白血病。我们的实验研究结果表明，乙双吗啉可使小鼠急性白血病发病率明显增加，与对照组相比，差异有非常显著性，提示乙双吗啉具有较强的致白血病作用。

微核实验是检测染色体损伤的一种重要手段。外来化合物在细胞周期各阶段诱导微核形成的能力与造成染色体畸变的能力平行，由于测定方法比较简便、快速、可靠，近年来该法已作为化学致突变实验中的常用的一种筛选方法^[14]。一些化合物诱发的基因突变与染色体畸变高度相关，而有些化合物不能引起基因突变却能引起染色体畸变，染色体畸变也是目前常用一种致突变的实验方法。我们的本次研究发现，乙双吗啉可使微核形成和染色体畸变增多，且有明显的剂量-效应关系，提示乙双吗啉可导致重要遗传物质的损害，从而诱发血液系统肿瘤的发生。

总之，本次研究结果表明，乙双吗啉可引起重要遗传物质DNA损伤，使小鼠外周血DNA-加合物和微核率显著增加，骨髓染色体畸变率显著增加，白血病发病率显著增加，至于其作用的详细机制尚待进一步研究。

 

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