二甲基甲酰胺对肾脏钙稳态影响的实验研究

中华劳动卫生职业病杂志 2001，19（1）

二甲基甲酰胺对肾脏钙稳态影响的实验研究

山东医科大学附属医院职业病科(济南市文化西路，250012)

菅向东 阚宝甜

目的：观察二甲基甲酰胺对肾脏钙稳态的影响，探索其肾脏损伤的可能发病机制。方法：分整体动物实验和体外实验两部分，整体动物实验方法首先是给予二甲基甲酰胺短期染毒，制备二甲基甲酰胺中毒大鼠模型，然后测定肾脏组织还原型谷胱甘肽的含量、Ca²⁺-ATPase活力及磷酸化酶α活力，常规制备组织病理切片，同时制备超薄电镜切片并观察。体外实验方法首先是采用超速冰冻离心技术分离鼠肾线粒体及微粒体，测定不同浓度二甲基甲酰胺作用下线粒体、微粒体Ca²⁺-ATPase活力。采用放射性同位素⁴⁵Ca示踪技术观察不同浓度的二甲基甲酰胺对线粒体、微粒体⁴⁵Ca主动摄取动力学及释放动力学的影响。结果：整体动物实验结果显示，二甲基甲酰胺可大大降低鼠肾组织还原型谷胱甘肽含量，抑制Ca²⁺-ATPase活力，增加磷酸化酶α活力，与对照组相比差异显著（P<0.05或0.01）。组织病理显示肾小管上皮细胞浊肿、变性、坏死，管腔内可见细胞管型。电镜观察可见肾近曲小管刷状缘微绒毛明显减少，线粒体出现肿胀、嵴脱落、空泡变性、内容物丢失、结构破坏等。内质网出现膨胀、扩张、结构破坏等。体外实验显示，二甲基甲酰胺可抑制线粒体、微粒体Ca²⁺-ATPase活力，与对照组相比差异显著（P<0.05或0.01），且具有明显的剂量一效应关系（r=0.915，0.924）。二甲基甲酰胺可抑制线粒体、微粒体对⁴⁵Ca的主动摄取，促进⁴⁵Ca从线粒体、微粒体被动释放，且具有明显的剂量-效应关系（r=0.918，0.895，0.886，0.846）。结论：二甲基甲酰胺可致肾脏钙稳态失调并导致肾脏损伤。山东大学齐鲁医院中毒与职业病科菅向东

关键词：二甲基甲酰胺  肾脏  中毒  钙稳态

Experimental Investigation of Dimethylformamide on Calcium Homeostasis of Rat

Kidney

Objective    To observe the effect of dimethylformamide on kidney calcium homeostasis and study the pathogenesis of kidney injury caused by dimethylformamide. Methods Dimethylformamide poisoning rat model were prepared at first. The content of GSH in kidney was determined, and the activities of Ca²⁺-ATPase and phosphorylase a were determined at the same time. Renal tissue slice was made by histotomy. The mitochondria and microsome of rat kidney were prepared according to Moore method. The influence of dimethylformamide on Ca²⁺-ATPase of mitochondria and microsome was observed. Radioactive isotope technique was used to observe the effect of dimethylformamide on ⁴⁵Ca transport dynamics of mitochondria and microsome in vitro. Results Dimethylformamide could decrease the content of GSH of rat kidney, inhibit the activity of Ca²⁺-ATPase, increase the activity of phosphorylase a of rat kidney. (P<0.01, compared with control group). Histopathology discovered that the cells of renal canaliculus epithelial swelled, degeneration and necrosis were found in many region. Cellular casts could been seen in some region. Electric microscopy observation discovered that microvilli of renal epitheliol cells were decreased significantly, mitochondria were swelling and vacuolar, some of them were damaged seriously. Endoplasmic reticulum was swelling. It was showed the dimethylformamide could inhibit the activity of Ca²⁺-ATPase of mitochondria and microsome, (P<0.05 or 0.01, compared with control group) and dose-effect relation were existed (r=0.915, 0.924). Dimethylformamide could inhibit the ability of ⁴⁵Ca uptake by mitochondria and microsome, and existed dose-effect relation (r-0.918, 0.895). Dimethylformamide could also enhance the release of ⁴⁵Ca from mitochondria and microsome, and dose-effect relation were found (r=0.886, 0.846). Conclusion: DMF may induce disturbance of calcium homeostasis in rat kidney and cause kidney damage.

Key words:  Dimethylformamide, Kidney, Poisoning, Calcium Homeostasis

 

二甲基甲酰胺（Dimethylformamide, DMF）是一种性能优良的高效有机溶剂，主要用于有机合成、染料、制药、腈纶制造、制衣、石油提炼、制革、乙炔萃取等行业。九十年代以前，国内有关二甲基酰胺中毒的报道多为个案报道及少数病例分析^[1，2]，九十年代以后，特别是近年来中外合资、外商独资项目及高新技术企业在我国不断涌现并迅猛发展，一些有毒有害作业也随之转嫁到国内，二甲基甲酰胺使用量猛升，群体中毒事件经常发生，中毒人数急剧增多，保护二甲基甲酰胺作业工人的健康成为当务之急，二甲基甲酰胺中毒已成为当前国内职业病专业人员密切关注的焦点之一。我们国家目前尚无二甲基甲酰胺中毒的职业病诊断标准，卫生部已将此项目列为国家职业病诊断标准研究课题^[3]。山东省拥于亚洲最大的二甲基甲酰胺生产和使用基地，八十年代末到九十年代初，我们在国内率先开展了二甲基甲酰胺的肝脏及免疫毒性研究，研究中发现，二甲基甲酰胺还具有不可忽视的肾脏毒性。近年来不断增多的二甲基甲酰胺中毒患者的临床表现也支持这一观点，事实上，二甲基甲酰胺肾脏损伤已成为其中毒性多脏器功能失常综合征的重要部分。钙离子对于细胞正常生理、生化功能的发挥及多种代谢过程的维持极为重要，细胞内钙稳态失调与细胞损伤、死亡过程之间存在着一定的内在联系^[4]。本研究通过整体动物实验和体外实验，采用高效液相色谱分析技术、超速冰冻离心分离技术、放射性同位素示踪技术、超薄切片的电镜观察技术等方法，从二甲基甲酰胺对肾脏钙稳态影响的角度出发，探索其肾脏损伤的可能作用机理及变化规律，为二甲基甲酰胺中毒的诊断、治疗、预防及职业病诊断标准的制订提供科学的理论依据。

   

材料和方法

1. 材料

1.1 实验动物  成年雄性SD大鼠，体重182±SD14g，由山东医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

    二甲基甲酰胺为防化学院化工厂产品，分析纯。

    ⁴⁵CaCl₂为中国原子能科学研究院产品，放射性比度为59mCi/gCa。

    三磷酸腺苷、哇巴因、双甘氨肽、糖原、Hepes、EGTA均为华美生物工程公司产品。

    葡萄糖-1-磷酸为德国Merck公司产品。

    还原型谷胱甘肽为上海酵母厂产品。

    无机磷试剂盒为北京化工厂产品。

1.3 主要仪器

    LS-9800型液体闪烁计数器，L6-50E型超速冷冻离心机均为美国Beckman公司产品。

    510型高效液相色谱仪（HPLC）系美国Waters公司产品。

    DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器（国产）。

    LKB-V型超薄切片机为瑞士产品。

2. 实验方法

2.1 整体动物实验

2.1.1 二甲基甲酰胺中毒大鼠模型的制备  成年雄性SD大鼠，体重182±SD14g，随机分为对照组、二甲基甲酰胺700mg/kg染毒组、二甲基甲酰胺1400mg/kg染毒组，每天灌胃1次，对照组同时给予等量蒸馏水，连续3次和6次，于末次染毒后24h断头处死动物，取其肾脏。

2.1.2 肾脏还原型谷胱甘肽（GSH）的测定  参照刘萍等建立的高效液相色谱分析方法进行^[5]。具体步骤如下：取新鲜肾脏组织0.5g洗净后用0.1M Na₃PO₄-0.05M EDTA缓冲液（pH8.0,H₃PO₄调整）7.5ml加10%的三氯醋酸溶液2ml制成匀浆，3000rpm，0-4℃离心30min，分离上清液2.0ml，加入0.1ml OPT-甲醇，反应20min后待分析。色谱条件：Waters 420荧光检测器，λex=338mm，λem=425nm，μBondapak CN柱；流动相0.05M Na₃PO₄-0.0025 M EDTA缓冲液（H₃PO₄调pH至6.7）；流速1.6ml/min。

2.1.3 肾脏Ca²⁺-ATPase活性测定  参照Chan法^[6]进行，略加修改。反应液含0.5mM ATP、60mM NaCl、1.2mM MgCl₂、0.05mM哇巴因、22M CaCl₂和0.75mM Tris-顺丁烯二酸缓冲液（pH7.0），酶液0.1ml，总体积0.5ml，反应液于37℃水浴中孵育30min，然后加0.04%孔雀石绿液（内含1%钼酸铵和0.06%Tween-20）2ml显色，1分钟后再加入24%柠檬酸钠0.4ml，30min后于660nm波长比色。酶活力单位以每mg蛋白催化生成的无机磷μM数表示。

2.1.4 肾脏磷酸化酶α活力测定  参照崔京伟法^[7]，略加修改。

具体步骤简述如下：取大鼠肾脏1.0g，置于预冷的介质液（含100mM NaF、20mM EDTA、0.5%糖原和50mM双甘氨肽，pH7.4）10ml制成10%的肾组织匀浆，3500rpm 0-4℃离心10min，取上清液0.5ml，孵育液（含100mM G-1-P、2%糖原、30mM NaF和1mM咖啡因）0.5ml，37℃孵育30min，然后加入0.5ml 20%的三氯醋酸和3.5ml双蒸水，3500rpm离心10min，取上清液0.1ml，参照试剂盒说明测无机磷含量。酶活力单位以上述条件下催化生成的无机磷μM数表示。

2.1.5 常规病理组织切片观察  取大鼠肾脏置10%福尔马林中固定，然后取出后石蜡包埋制片，HE染色，光镜下观察并摄片。

2.1.6 超薄电镜切片观察  速取大鼠肾脏切成1mm³大小块状，固定于4%戊二醛内，置4℃冰箱过夜后移至0.1M PBS液中浸洗，过夜（4℃），1%O_sO₄后固定1h（4℃），0.1M PBS洗3次，共30min。50%、70%、90%、95%、100%乙醇脱水各10min。环氧丙烷渗洗10min，环氧丙烷包埋剂（1：1）渗透4h，然后再用环氧丙烷包埋剂（1：2）浸透过夜，包埋于Epon-821混合包埋剂，40℃24h后再移入60～65℃ 24h，修块，用LKB-V型超薄切片机切片，捞于200目 Forma膜铜网上，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜下观察并摄片。

2.2 体外实验

2.2.1 大鼠肾脏线粒体、微粒体的制备  参照Moore法^[8]进行。大鼠禁食过夜，次日断头处死，迅速取其肾脏，于预冷至0℃的介质液中洗净。介质液为0.25M庶糖溶液（pH7.5），然后按每克肾脏重量加8ml冰冷的介质液制备匀浆，600g冰冻离心5min，留上清，弃沉淀，上清9,000g冰冻离心30min，收集上清液备用，沉淀部分即线粒体。线粒体用介质液冲洗，然后接上述方法再离心回收，反复2次，沉淀部分即为纯净的线粒体。取备用上清液于105,000g冰冻离心60min，收集沉淀部分即为微粒体。蛋白定量参照Lowry法进行。

2.2.2 孵育体系的建立及Ca²⁺-ATPase活力测定  参照2.1.3部分，二甲基甲酰胺终浓度分别为0、65、130、195μM，37℃水浴孵育30min。

2.2.3 二甲基甲酰胺对线粒体、微粒体⁴⁵Ca摄取和释放动力学的影响

    ⁴⁵Ca主动摄取动力学测定参照Moore法^[8]略加改进。反应液含100mM KCl、30mM咪唑一组氨酸缓冲液（线粒体测定时pH为7.4，微粒体测定时pH为6.8，用咪唑调整）、5mM叠氮钠（线粒体测定时不加）、5mM MgCl₂、 5mM草酸胺、5mM ATP、20μM CaCl₂。线粒体、微粒体（0.1-0.5mg蛋白）加入反应介质，蛋白定量参照Lorry法进行。设计不同组别，使二甲基甲酰胺终浓度分别为0、65、130、195μM，作用时间分别为0、5、10、20、30min，置37℃水浴孵育，总孵育时间为30min。然后加入0.1μCi⁴⁵Ca，线粒体再孵育15min，微粒体再孵育30min。49型玻璃纤维滤膜真空抽滤，然后用0.2M pH7.5的蔗糖液和蒸馏水各冲洗一遍，凉干后用液体闪烁计数仪测定其放射性，并换算成⁴⁵Ca的摄取量。⁴⁵Ca被动释放的测定参照Tsokos-Kuhn法^[9]进行。线粒体、微粒体加入⁴⁵Ca的缓冲液，然后置4℃冰箱内，使⁴⁵Ca能够充分进入线粒体和微粒体。缓冲液含100mM KCl、5mM MgCl₂、20mM Hepes，pH7.5，1μCi ⁴⁵Ca，总体积为1ml，蛋白含量线粒体2.75mg，微粒体1.80mg。18小时后加二甲基甲酰胺染毒，使其终浓度达0、65、130、195μM，37℃孵育30min，然后取0.1ml稀释到1ml，稀释液为上述缓冲液但不加⁴⁵Ca。加入0.5mM EGTA（终浓度），螯合膜外Ca²⁺，启动Ca²⁺从膜内释放，按一定时间（0、1、2、4、8min）间隔取出部分样品，用49型玻璃纤维滤膜真空抽滤终止反应，置液体闪烁计数仪中测定线粒体、微粒体⁴⁵Ca残留量。统计学处理采用t检验方法。

 

实 验 结 果

1. 整体动物实验

1.1 二甲基甲酰胺对肾脏组织还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响  结果如表1所示，肾脏GSH含量在二甲基甲酰胺3次染毒后即大幅度降低，与对照组比差异非常显著（P<0.01），6次染毒后仍维持在较低水平。

1.2 二甲基甲酰胺对肾脏组织Ca²⁺-ATPase活力的影响  结果如表2所示，二甲基甲酰胺3次染毒后，肾脏Ca²⁺-ATPase活力即降低，6次染毒各染毒后组Ca²⁺-ATPase活力较对照组明显降低，差异非常显著（P<0.01）。

1.3 二甲基甲酰胺对肾脏组织磷酸化酶α活力的影响  结果如表3所示，二甲基甲酰胺3次染毒后肾脏磷酸化酶α活力变化不明显，6次染毒后大小剂量组磷酸化酶α活性均显著高于对照组（P<0.01）。

1.4 二甲基甲酰胺染毒大鼠肾脏组织病理变化  结果如图5～8所示，二甲基甲酰胺染毒可使肾脏组织损伤，损伤部位主要在肾小管，低剂量组可使肾小管上皮细胞浊肿变性及点状坏死，高剂量组可使肾小管上皮细胞呈现小片状坏死，坏死区可见炎性细胞浸润，部分肾小管管腔内可见明显的细胞管型，提示损伤严重。肾小球病变不明显。

1.5 二甲基甲酰胺染毒大鼠肾脏组织超微结构变化  结果如图9～14所示，对照组大鼠肾脏近曲小管上皮细胞分界清楚，核膜清晰可见，线粒体丰富，结构完整，嵴较多，基质丰富，内质网结构完整。细胞的游离端有较多微绒毛，微绒毛排列紧密规则。二甲基甲酰胺染毒后可见肾脏近曲小管上皮细胞内质网明显扩张、膨胀、膜结构破坏。线粒体嵴稀少，基质减少，有些线粒体已发生空泡变性，内容物丢失，结构破坏。同时还可观察到上皮细胞微绒毛明显减少，排列稀疏，不规则。

2. 体外实验

2.1 二甲基甲酰胺对大鼠肾脏线粒体、微粒体Ca²⁺-ATPase活力的影响  结果如表4、5所示，二甲基甲酰胺对大鼠肾脏线粒体、微粒体Ca²⁺-ATPase均产生明显的抑制作用，与对照组相比差异显著（P<0.01），且存在剂量一效应关系（r=0.915, 0.924）。

2.2 二甲基甲酰胺对大鼠肾脏线粒体、微粒体⁴⁵Ca转运动力学的影响  二甲基甲酰胺对大鼠肾脏线粒体、微粒体⁴⁵Ca主动摄取动力学的影响结果如表6、7及图1、2所示，二甲基酰胺能明显抑制大鼠肾脏线粒体、微粒体对⁴⁵Ca主动摄取能力，各染毒剂量组与对照组相比，差异显著（P<0.05或0.01），且存在明显的剂量-效应关系（r=0.918,0.895）。二甲基甲酰胺对大鼠肾脏线粒体、微粒体⁴⁵Ca被动释放动力学的影响结果如表8、9及图3、4所示二甲基甲酰胺能明显促进⁴⁵Ca从线粒体、微粒体中被动释放，与对照组相比差异显著（P<0.05或0.01），且存在明显的剂量-效应关系（r=0.886，0.846）。综上所述，二甲基甲酰胺使线粒

体、微粒体中钙池呈现外流趋势。

 

讨 论

已往对二甲基甲酰胺的毒性研究，多集中在其消化道症状及肝脏损伤方面^[10～13]，近年来随着二甲基甲酰胺的使用量猛增，中毒症例也急剧增多，其肾脏毒性已引起了人们的高度重视，事实上中毒性肾损伤已成为二甲基甲酰胺中毒性多脏功能失调综合征的重要部分，成为职业病临床工作人员不可忽视的问题。前苏联学者对二甲基甲酰胺作业工人五年跟踪观察表明，二甲基甲酰胺作业工人血尿素氮升高，内生肌酐清除率下降，说明其肾功能已受到损伤^[14]。国内严鸿才报道一例二甲基甲酰胺中毒死亡者尸体解剖发现，死者除肝脏损害外，肾脏也明显肿大，近曲小管上皮细胞大多变性坏死，细胞破碎，基底膜尚完整^[15]。Costa的实验研究也证实，动物吸入一定浓度的二甲基甲酰胺后即可造成肾脏损伤^[16]。文献报道，肾毒物质在吸收后，随血液流经肾小球滤过，然后到达肾小管，随着滤过液在肾小管的重吸收，毒物浓度大大增高，远远超过其在血液中的浓度，从而直接损害肾小管上皮细胞^[17]。本次研究病理结果证实，二甲基甲酰胺确实可使肾小管上皮细胞浊肿变性，甚至出现点状或片状坏死，管腔内可见大量细胞管型。超微结构观察，二甲基甲酰胺主要损及肾脏近曲小管上皮细胞线粒体、内质网及微绒毛，使其正常结构破坏、功能丧失。

钙稳态失调学说是近年来兴起的从分子水平研究中毒机理的新观点^[18]，化学物质引起细胞毒性损伤涉及体内一系列生理、生化过程的紊乱。近年来许多研究结果表明，中毒性损伤与胞内钙稳态之间存在着内在联系，细胞内钙的转运和利用及其与中毒损伤发生和发展之间的关系是当前实验毒理学微观研究的热点之一，也是中毒性疾病诊断、防治研究的前沿课题。细胞钙池可分为细胞外池和细胞内池，细胞内池又可分为胞浆池、核池（缓慢交换性）及线粒体池（为不溶性钙，非交换性）。胞浆池为动力性池，它又可分为线粒体、内质网和胞液三个部分。细胞在静息状态下，线粒体、内质网钙离子浓度达10^-3mol，胞浆游离钙离子的浓度达10^-7mol，钙离子浓度梯度差为10⁴。根据对细胞钙离子转运动力学的分析，线粒体内钙离子循环总量比内质网大两个数量级，细胞内大部分钙离子是隔离在线粒体内，线粒体对调节胞浆游离钙离子浓度起重要作用，但线粒体池很不稳定，易受某些因素如毒物的影响^[19]。本次研究结果表明，二甲基甲酰胺不仅能够抑制线粒体对钙离子主动摄取能力，而且也能促使钙离子从线粒体内被动释放，且有明显的剂量一效应关系，两者共同作用的结果，使线粒体内钙离子呈现外流的趋势。内质网是某些化学物质进行生物转化的靶部位，Becker等认为，线粒体钙流循环可由内质网依赖于能量的钙隔离作用所调节，两者对钙转运的联合作用，使细胞浆游离钙离子浓度维持在0.2～0.5μM之间。卤烃类化合物和二硫化碳均可的抑制微粒体钙泵，从而引起细胞内钙稳态失调。本次研究结果证实，二甲基甲酰胺不仅可抑制微粒体对钙离子的主动摄取，也可促使其从微粒体内被动释放，且存在剂量-效应关系，提示二甲基甲酰胺可降低内质网对钙离子的封闭作用，使其对钙离子的隔离作用减弱或消失。细胞内钙稳态维持是一个极其复杂的生理过程，细胞质膜、线粒体及内质网等均参与调节细胞胞浆内游离钙离子的浓度，使之处于一个较低的水平，钙离子在以上三种生物膜上的转运，构成了钙稳态的主要环节，线粒体、内质网对细胞内钙离子的隔离作用主要取决于其对钙离子的摄取和释放两个过程之间的平衡^[20]。本次研究结果表明，二甲基甲酰胺对肾脏线粒体、微粒体钙离子的摄取和释放动力学均可产生不良影响，从而降低了它们对胞浆钙离子的调节缓冲能力，因此具有重要的毒理学和病理生理学意义。

细胞内还原型谷胱甘肽耗竭与中毒性损伤密切相关，还原型谷胱甘肽的主要功能是对抗氧化剂对巯基的破坏作用，保护细胞膜中的蛋白质和含巯基的酶不被氧化，还原型谷胱甘肽和毒物的结合是机体重要的解毒方式，组织中还原型谷胱甘肽含量的测定可作为毒物对机体影响的生物监测手段之一^[21]。实验证明，某些毒物如溴苯等在引起细胞内还原型谷胱甘肽含量降低时，线粒体外某一区域

（主要是内质网）的钙隔离作用失调，并迅速出现细胞表面疱状物，因此细胞内巯基状态与钙稳态失调之间有着密切联系。Ca²⁺-ATPase在调节钙离子转运过程中起着极其重要的作用，该酶活性抑制会迅速引起细胞内钙离子浓度升高，已证实许多毒物如四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、滴滴涕等对Ca²⁺-ATPase具有严重的抑制作用。近年来的研究工作表明，Ca²⁺-ATPase与细胞的巯基池状态密切相关，一系列的实验结果证实，氧化应激时，毒物对质膜和内质网的巯基氧化及对Ca²⁺-ATPase活性的抑制将促使细胞内钙稳态失调^[22]。本次实验结果表明，二甲基甲酰胺可使大鼠肾脏还原型谷胱甘肽的含量大幅度降低，整体动物实验及体外实验均证实，二甲基甲酰胺可抑制肾脏Ca²⁺-ATPase活力，且存在剂量一效应关系。以上结果提示，在二甲基甲酰胺肾损伤过程中，组织巯基耗竭与 Ca²⁺-ATPase活力抑制起重要作用，至于其作用的详细机制，尚待进一步探讨。

本次实验结果表明，二甲基甲酰胺可导致胞浆内磷酸化酶a活性升高， 提示二甲基甲酰胺对肾脏钙稳态影响的最后结果是导致胞浆钙稳态失调，胞浆游离钙离子浓度过度升高。文献报道，胞浆内钙离子浓度若持续过度升高，将触发一系列细胞反应过程，如激活磷脂酶和蛋白酶，使细胞内磷脂和蛋白质分解，活化核酸内切酶，使之参与细胞凋亡坏死过程或程序性细胞死亡，最终导致细胞功能障碍、损伤乃至死亡，从而引起组织损伤。

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