DNA-蛋白交联物与药物相关性白血病的关系探讨

职业与健康2006年10月22卷19期

DNA-蛋白交联物与药物相关性白血病的关系探讨

菅向东¹ ，张华²，阚宝甜¹ ，隋宏¹ ，张玲³ ，楚中华¹山东大学齐鲁医院中毒与职业病科菅向东

（1山东大学齐鲁医院，山东 济南 250012；2山东省枣庄市立医院，山东 枣庄 277102 ；宁夏自治区人民医院，宁夏 银川，750021）

 

1982年我国首次合成抗肿瘤药乙双吗啉并迅速广泛应用于临床，随后陆续发现它具有很强的致白血病作用，短短30余年，与乙双吗啉相关的白血病病例报道已达数百余例，我们在以往研究的基础上成功制备了乙双吗啉相关性白血病动物模型。随着分子生物学的迅猛

发展，目前较肯定的认为白血病是一种基因病变，DNA的不可逆损伤是这种病变发生的基础，DNA-蛋白交联物是近年来备受关注的除DAN-加合物之外的另一类生物大分子的重要遗传损害，它的形成可影响基因的表达，破环染色体的正常结构，在DNA复制过程中必然造成某些重要遗传信息的改变和丢失，从而诱发突变及肿瘤的发生^[1-3]。本研究以乙双吗啉为研究工具，采用现代分子生物学分析技术、放射性同位素后标记技术对DNA-蛋白交联物与化学因素相关性白血病发生发展的之间的关系进行深入细致的研究，以期从分子水平解释化学因素致白血病的发展规律，并探讨它作为化学因素相关性白血病基因诊断指标的可能性，为今后发展包括基因治疗在内的生物治疗提供理论依据。

材料和方法

1 材料

实验动物：615纯系小鼠，购于中国医学科学院血液病研究所动物实验室，雌雄各半，9周龄，体重18-21g,

实验试剂：

乙双吗啉，辽宁抚顺市化工研究设计院化工实验厂提供，纯度>99%

[γ-³²P]ATP(222GBp/μmol),美国Dupont公司产品。

Na¹²⁵I购与中国原子能科学研究院院，放射性强度为170Ci/L

PEI-Cellulose薄层层析板，德国Brinkman公司产品。

其他试剂包括RNase AA,蛋白酶K,牛脾磷酸二酯酶，微球菌内切酶，核酸酶P1，T4多聚核苷酸激酶，Bicine,Spermidine,DTT,HEPES，RPMI1640，小牛血清，青霉素，链霉素，植物血球凝集素，碳酸氢钠，羟基脲，二甲基亚砜，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，乙酸，乙二胺四乙酸，氚-胸腺嘧啶核苷，硫氰酸钠，脱氧核糖核酸，三氯醋酸，过氯酸，无水乙醇，甲苯闪烁液。

主要仪器：

超速冰冻离心机，Eppendorf公司产品。

紫外分光光度计，Beckman公司产品。

LS6000SE液体闪烁计数仪，Beckman公司产品。

液闪杯，Sigma公司产品。

 

2方法

2.1 整体动物实验

2.1.1 实验动物染毒及观察方法

整体动物实验 选取实验动物615纯系小鼠80只，随机分为1mg,2mg及4mg不同剂量

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山东省卫生厅计划项目（项目编号1996CAICJB5）

乙双吗啉染毒组及对照组,每组20只小鼠，雌雄各半。染毒方法为将不同剂量乙双吗啉用蒸馏水稀释，制成0.5ml混悬液，每日一次灌胃，对照组同时给予等量蒸馏水，连续染毒两个月后停止染毒观察饲养，第3-5个月每个月检查一次外周血象，从第6个月开始每半个月检查一次外周血象，有白血病表现征象者密切观察，每周称体重1次，有不能进食、精神不振者立即活杀，取血、骨髓等组织置液氮灌内保留，肝脏、肾脏、肺、脾、胸腺等组织行常规组织病例切片。所有动物均于染毒9个月后处死，取血及骨髓等组织与以前保留组织一起进行DNA-蛋白交联物外周血象及骨髓象等有关测定。同时取肝脏、肾脏、肺、脾、胸腺等组织行常规组织病理切片。

2.1.2 DNA-蛋白交联物（DPCs）的测定 参照庄志雄等建立的方法^[4]进行。取小鼠血1ml，按第一部分2.1.2方法提取DNA,用紫外分光光法测定DNA浓度和纯度，OD（260nm/280nm）>1.75，则认为DNA纯度合格，非共价交联的蛋白质已基本剔除，剩下的是与DNA共价结合（交联）的残留多肽链及氨基酸。取100μgDNA溶液置于离心管中，经乙醇沉淀并干燥后加入重悬液（2%SDS,30%脲素，0.5M Tris-HCl,Ph7.6）100μl溶解，再加10μCi Na¹²⁵I、5μl氯胺T(6mg/ml)标记，室温反应2min后加入10μl 20%β-巯基乙醇还原，然后乙醇反复冲洗合沉淀DNA三次，即可获得用于检测的DPCs标记样本。检测时1个样本同时进行γ计数合DNA测定，DPCs单位为cpm/μgDNA。

2.2体外实验

外周血DNA-蛋白交联物的测定 取健康615纯系小鼠血白细胞以4×10⁶细胞数作为一个样本，8个样本为一组，接种于100mm玻璃平皿上，在10%小牛血清的DMEM，5%CO2,37℃的环境中培养40h,再以SGM（HEPES50Mm Ph7.2,NaCl100Mm,KCl5Mm,CaCl 2mM,Glucose5mM）10ml换液，然后加入乙双吗啉二甲基亚砜混悬液，使其终浓度为0,10μM,20μM,40μM,80μM,再培养5h。然后将细胞及液体移置离心管中，PBS冲洗，3000rpm 5min离心沉淀后一次加入消化液（NaCl100Mm,Tris10mM,pH8）,SDS(0.5%)，RNase(100μg/ml)和蛋白酶K(300μg/ml)，总量1ml,再45℃以下震荡过夜，然后按常规方法用酚-氯仿进行DNA抽提二次便可获得含交联蛋白的DNA,即DPCs。参照2.1.3方法进行DPCs测定。

3 统计学处理 采用SSPS11.5软件做统计学分析，以P?0.05表示差异有显著性。

 

表1 乙双吗啉染毒小鼠白血病发病情况

组别        n      白血病小鼠数    白血病发生率（%）          

1mg        20         3            15**

2mg        20         5            25**

4mg        20         5            25**

对照组     20         0             0

与对照组比，**P<0.01

 

 

表2乙双吗啉染毒后小鼠DNA-蛋白交联物变化（X+S）

组别        n           DPCs （cpm/μgDNA）             

1mg        20          2102.64+197.22**    

2mg        20          2978.84+235.88**    

4mg        20          4857.62+593.27**    

对照组      20          1345.93+164.23**    

与对照组比，**P<0.01

 

表3乙双吗啉对小鼠外周血白细胞DNA-蛋白交联物影响的体外试验（X+S）

组别          n      DPCs （cpm/μgDNA）         

10μM        8      82.10+37.42**   

20μM        8      146.29+36.98**  

40μM        8      268.32+54.56**    

80μM        8      378.54+68.64**  

对照组        8      43.88+25.68     

与对照组比，**P<0.01

 

4．结果 实验结果如表1、表2、表3所示，整体动物实验表明，乙双吗啉染毒可使小鼠白血病发病率明显增加，与对照组相比差异非常显著（P<0.01）。整体动物实验和体外实验均表明，乙双吗啉可与DNA作用形成DNA-蛋白交联物，与对照组相比，差异非常显著（P<0.01）。

5．讨论

DNA-蛋白质交联（DNA-protein crosslinks,DPCs）是环境理化因素对生物大分子物质的一种重要遗传损害，其作为外来化学物的毒作用分子生物标志近年来已受到关注。DPC最初起于研究紫外线和电力辐射对DNA的损伤，以后也用于观察某些抗肿瘤药物包括顺铂等的生物效应，近年来则发现，许多环境污染物和化学致癌物包括烷化剂，苯丙（a）芘、砷化物醛类化和物以及一些重金属如铬、镍等均可引起DPCs，对于外来化学物与DPCs的联系，国外近10年来虽有不少报道，但然仍在探索中^[4-6]。对于DPCs形成的机理目前还不完全清楚，国外的研究认为于下列因素有关：（1）羟基自由基（OH^?）是引发DPCs的重要因素，可见光、电离辐射、化学氧化剂等均可致细胞内超量的羟基自由基形成而引发DNA和蛋白分子上的自由基反应，从而导致DPCs，如果羟基自由基清除剂存在，则可阻碍DPCs的形成，如电离辐射所诱导的DPCs可因羟基自由剂清除剂的存在而减少。（2）细胞内巯基水平的降低有利于DPCs形成，许多巯基反应基可提高细胞的DPCs水平，这可能与因巯基的清除引起的羟基自由基代谢活性升高有关，或于某些蛋白质易于成为某些DPCs的底物有关。人类肺肿瘤细胞经用谷光甘肽合成抑制剂处理后，GSH水平明显下降，同时细胞内DPCs本地水平增加1倍以上。有些化合物可直接介导蛋白质的氨基酸残疾上的功能基团与DNA分子中的碱基共价结合，如甲醛、顺铂以及铬、镍等过渡金属等。但最近的研究表明，过度金属也可能通过激活氧自用基反应，间接地诱导DNA损伤和蛋白质氧化而引起DPCs。（4）其他因素：细胞内环境的因素也可影响DPCs的形成。有人认为缺氧可导致染色单体结构改变而有利于形成DPCs，高渗环境会引起染色单体浓缩而不易形成DPCs，相反低渗则有利于DPCs。不同的关联因素引起DPCs的机理及共价结合物的形式不尽相同，如紫外线在DNA碱基环状结构上引起自由基反应，再与邻近蛋白质形成共价结合物，近年来的研究表明，许多外来化合物均可引起DPCs，虽然不同的化学物引起DPCs的机理不尽相同，但DPCs一旦形成，必将对DNA的构象与功能产生严重影响，这可能与和DNA交联的核蛋白质有关，因为核蛋白是维持DNA构象的重要组成成分，并参与调控DNA的复制与转录，此外，由于DPCs修复困难，在DNA复制过程中，可造成某些重要的基因丢失，因此，DPCs作为遗传毒性的生物标志物可能具有重要的价值。在探索DPCs的生物学方面，国外近10年虽有不少研究报道，但由于实验方法的局限性，其中大多数结果是来自离体细胞模型，整体动物实验的报告不多，而国内在这方面的研究也很少，因此对于DPCs的体内生物学意义目前仍在探索中^[7，8]。但根据现有的研究成果，DPCs作为外来化学物的生物标志可能有重要的价值。主要已依据有：（1）许多环境污染物和化学致癌物包括烷化剂苯并（a）芘，氯仿、砷化物、醛类化合物以及一些重金属等具有较强的致DPCs的能力。（2）与其它类型的DNA损害相比，DPCs较难修复，在细胞周期中持续时间较长，当DNA复制时，已造成一些重要的基因（ 如抑癌基因）丢失等。目前已有研究证明DPCs与某些化学物的诱变性和致癌性有关。（3）与其他DNA损伤标志相比，DPCs在体内有一定的持久性。一些研究表明DPCs在暴露与交联剂后一段较长的时间仍易于检出。其持续时间甚至比某些加合物还要长。（4）除了实验室外，DPCs也可用于人群调查。有研究表明，人血淋巴细胞可作为生物标志反映化学物的接触情况。（5）随着DPCs研究方法的发展，除了传统的方法外，现在已有不少能对DPCs进行分离和准确定量的先进方法，也不乏可应用于人群研究的简单灵敏已推广的方法。先进的检测方法无疑为DPCs的分离、定量合成分析等方面的研究提供了良好的条件。因不同的毒物引起DPS的交联蛋白和DNA序列均不尽相同，利用先进的方法鉴定DPCs可在一定程度上反映其特异性。Costa 1991年根据DPCs的蛋白分子量、等电点、水解图谱以及与多克隆抗体的反映情况等，证实铬所引起的交联蛋白主要是肌动蛋白，有研究表明这种蛋白在核基质中含量丰富，是参与DNA转录和修复的重要成分。

乙双吗啉是丙亚胺类药物，与丙亚胺、乙亚胺有着相似的药理作用，它是中国科学院上海药物研究所70年代设计合成的，该药通过乙亚胺的酰亚胺氮原子上引进吗啉甲撑基，化学名为1，2-双（4-吗啉甲撑-3，5-二氧哌嗪）-乙烷，它于1979年临床试用，1982年正式用于临床，细胞动力学研究表明，该药有阻滞DNA合成的作用，用于治疗淋巴瘤、肺癌及胃癌等。由于对银屑病治疗效果较佳，倍受银屑病人及基层医院欢迎，故在皮肤科应用较多。当初在临床应用时它被认为几乎无不良反应，但随着应用的广泛及用药时间的延长，人们逐渐发现它能使有些用药者发生药物相关性白血病，当乙双吗啉治疗后出现白血病时，曾有人认为是一种偶然的巧合或认为银屑病与白血病的发生都与病人的免疫缺陷有关，二者是同一个病因。随着研究的深入，人们发现乙双吗啉有致畸作用，乙双吗啉与白血病有相关关系，且白血病的类型绝大多数为急非淋，同时研究也发现银屑病病人白血病的发病率与一般人群无显著性差别。国外对其诱变性研究尚未见报道，但对其同系物丙亚胺引起的白血病报告较多。国内实验证明乙双吗啉具有强诱变性，作用于紫露草的细胞染色体和纺锤体，使染色体发生畸变，纺锤体断裂，由此可认为乙双吗啉诱发白血病的机理是作为一种染色体毒物，引起人体染色体畸变而致白血病^[9-11]。

本次研究结果表明，乙双吗啉可使小鼠白血病发病率明显增加，乙双吗啉无论是在体内还是在体外均可导致DNA-蛋白交联物的形成，且存在明显的剂量-效应关系。提示，在乙双吗啉致白血病过程中，DNA-蛋白交联物的形成可能起到一定的作用，至于其详细的作用机制和其发生、发展、演变的具体过程，尚需要进一步研究。

参考文献

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