氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞旁分泌活化途径的抑制作用

                         被浏览了173次, 时间: 2008-07-24 00:00:00

                           中华肝脏病杂志2004年3月第9卷第1期       上海华山医院感染病科尹有宽

                            卢清 张清波 张继明 尹有宽 邬祥惠
 
【摘要】 目的 观察氧化苦参碱对大鼠激活肝星状细胞(HSC)这一旁分泌活化途径的影响。方法 分离正常及CCI 损伤肝库普弗细胞(KC)，进行体外培养，收集损伤肝KC条件培养液(IKCM)及药物(氧化苦参碱，Oxy)干预后的条件培养液(Oxy?IKCM)，以IKCM及Oxy?IKCM 添加于原代培养的未活化HSC培养体系中，观察Oxy对KC旁分泌激活HSC的影响，生物学方法检测Oxy对活化的KC分泌TGF~3．的影响。结果 急性损伤肝KC对HSC的增殖有促进作用，氧化苦参碱可抑制KC对HSC增殖的促进作用，并可抑制活化KC分泌的TGF~3．。结论 氧化苦参碱可通过抑制旁分泌途径抑制HSC活化及活化KC分泌的TGF~3．。
【关键词】 氧化苦参碱；肝纤维化；肝星状细胞；肝库普弗细胞；旁分泌；TGF~3．
The inhibition effect of oxymatrine on the activation of paracrine pathway of hepatic stellate cells L【，Qing．ZHANG Qingbo，ZHANG Jiming，el al The Department of Infectious Disease，Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040，China
【Abstract】Objective To investigate the effect of oxymatrine(Oxy)on the activation of hepatic stellate cells(HSC) through paracrine stimulation by Kupffer cells(KC) Methods Hepatic Kupffer cells and hepatic stellate cells from rats were isolated and cultured．Conditioned culture medium of Kupffer cells(KCM)and Oxy treated KCM(Oxy?KCM)from acute in?jured rat liver induced by CCI4 were collected．KCM and Oxy-KCM were added to the primary culture quiescent HSC medium，after co-cultured for 48 and 72 hours．the proliferation of HSC were investigated by MTT colorimeter assay．Secretion of TGF~I by KC was assayed by biological test．Results Oxymatrine can inhibited the proliferation of HSC through paracrine stimulation of activated Kupfer cells by suppresing TGF~I secrtion．Conclusion Oxymatrine can inhibit the proliferation of
HSC through paracrine stimulation by suppresing the TGFt31 secreted by activated Kupfer cells．
【Key words】Oxymatrine；Hepatic fibrosis；Hepatic stellate cells；Hepatic kupffer cells；Paracrine；TGF~31
肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，肝星状细胞(HSC)在此过程中起关键作用。HSC活化是一复杂过程，其中旁分泌活化途径是HSC活化启动的关键因素，库普弗细胞(KC)是活化这一途径的主
要细胞之一。氧化苦参碱(0xymatrine，0xy)是从中药苦豆子和苦参根中提取的生物碱，其对大鼠HSC增
殖及自分泌TGF~31有抑制作用_1本研究主要观察Oxy对KC激活HSC这一旁分泌活化途径的影响。
材料与方法
一、材料
雄性Wistar大鼠，SPF级，体重200～300g，分离KC用；体重400～450g，分离HSC用，均由上海中医
药大学动物中心提供。链霉蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶、
作者单位：200040 上海复旦大学附属华山医院传染科
Nycodenz均为Sigma公司产品；199培养液、F12培养液、DMEM 培养液及RPMI一1640培养液均为Gibco公司产品；噻唑蓝(MTT)及小牛血清(FBS)为华美生物工程公司产品；貂肺Mv一1-LU上皮细胞株购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。氧化苦参碱为白色结晶，纯度>97％，由宁夏绿谷药业有限公司惠赠。
二、方法
(一)造模 大鼠以50％四氯化碳一橄榄油溶液灌胃，0．05ml／100g，48h后分离KC。
(二)KC分离培养参照文献进行_3 J，正常肝KC得率约为2×10 ，损伤肝KC得率为1×10 个／肝，经
Latex Beads吞噬实验鉴定，细胞纯度>90％ 。
(三)HSC分离培养参考文献1。
(四)KC条件培养液制备 正常肝与损伤肝KC均以10％ FBS／F12培养24h，弃培养液，换无血清199
培养液继续培养24h，收集培养液，一70。C保存，即为正常肝KC条件培养液(NKCM)与损伤肝KC条件培养液(IKCM)。
(五)HSC的条件培养液 NKCM 和IKCM 分别用199培养液稀释成10％ 和20％ 浓度，加入10％FBS混匀。将原代HSC随机分组，每组4个复孔，分别加入各稀释浓度的KCM，100ul／~k，分别作用48h与72h。各时间均设对照组，加10％ FBS 199培养液，培养至各时间点。
(六)经药物作用的IKCM 收集 大鼠四氯化碳造模48h后按上述方法分离肝KC，接种于6孔板中。接种密度为0．5×107个／ml，2．5ml／孔。贴壁纯化后，更换含10％NBS的F12药物稀释液(药物浓度为
10-4mol／L)，培养24h，弃上清液，换无血清199培养液继续培养24h，收集其培养上清液作为药物作用过的ICKM(oxy?ICKM)，一70 保存。
(七)不同KCM 对HSC的作用 NKCM、IKCM和Oxy?IKCM分别用199培养液稀释成10％和20％，加入10％FBS混匀。原代培养96孔板中细胞4孔为1组，分别更换稀释好的各组KCM lOOt~l／孔。设2块
完全相同KCM 添加的96孔板，按培养时间点不同，分别培养48h和72h。各时间点均设正常对照组4
孔。每24h按原组别以原KCM 培养液换液一次。
(八)HSC增殖的检测(MTT法) 各组培养至时间点后进行MTT法增殖检测。
(九)氧化苦参碱对活化的KC TG即1分泌的影响 TG即1活性以未酸化的KCM 对Mv一1一LU 细胞
的增殖抑制率反映。
三、统计方法
计量资料以 ±S表示，两组间均数比较用成组t检验，多组间的均数比较用单因素方差分析，方差分析
结果显示组间均数差别有统计学意义(P<0．05)时，进一步用bonferroni法作两两比较。同时考虑浓度和
分组作用时，用两因素方差分析。
结 果
一
、KCM 对HSC增殖的影响 各浓度NKCM 在各时相对HSC增殖均无影响。IKCM有明显促HSC增殖作用，但时效和量效关系不明显(见表1)。
二、氧化苦参碱对IKCM 促HSC增殖的影响与对照组相比，IKCM 组在培养48h和72h，HSC的MTT A值均高于对照组，表明对HSC的增殖有促进作用(P<0．01)，氧化苦参碱可抑制这种促进作用，并呈一定的时效性(P<0．01)，反映药物能显著抑制Chinese Hepatology，Mar 2004，Vo1 9，No．1KC病理性促HSC增殖作用(见表2)。
表1 正常大鼠与损伤大鼠肝KCM 对HSC增殖的影响(X±s)两因素方差分析，对照组与NKCM 组间差异无统计学意义，F=0．37，P=0 37；对照组与IKCM 组间差异有统计学意义，F：28．51，P=0．000，P<0 05；不同IKCM 浓度间差异无统计学意义，F=0．35，P=0．5642
表2 氧化苦参碱对IKCM促HSC增殖的影响(i±s)两因素方差分析，对照组与IKCM 组间差异有统计学意义，F=36．74，P=0 000，P<0．0l；48h时药物干预组与IKCM 组间差异无统计学意义，P>0 05；72h时药物干预组与IKCM组间差异有统计意义，P<0．01
三、 FGF~I变化及药物对其影响
IKCM 分泌的TGF~I活化比NKCM 分泌的明显增强，含药血清对其活性病理增强有明显抑制作用(见
表3)。表3 氧化苦参碱对活化的KC分泌TG 总量的影响( ±s)与ICKM 比较： F=23．51。尸<0 01
讨 论
HSC的活化过程涉及其旁分泌和自分泌调控机制，且HSC活化的启动主要与旁分泌有关。肝KC与
HSC毗邻分布于肝窦间隙内，KC的激活早于HSC的活化。激活的KC 可产生大量的细胞因子，主要有
TGFI31、血小板衍生生长因子(PDGF)、IL一6、肿瘤坏死
因子(TNF)等及自由基等过氧化产物，通过旁分泌机制，作用于邻近的HSC，使之激活 ．5 J。研究表明，正常肝KC对HSC的增殖无激活作用，而损伤后KC对HSC增殖的激活作用明显增强。本实验也证实了这点。其中TGF~I是持续HSC活化的主要细胞因子之一， 在肝纤维化阶段主要由活化的HSC分泌，并可通过自分泌方式促进自身的活化，但肝损伤的初期，活化的KC TGF~1分泌明显增加，并通过旁分泌作用促进HSC分泌TGF~I，亦可促进其自身受体的表达，激活HSC的细胞内信号转导通路，促进HSC的活化及ECM 合成的增加。PDGF被认为是最强的HSC增殖促进因子，损伤肝KC对HSC增殖的促进作用主要是由PDGF介导的，但静止的HSC表面不表达PDGF受体 ，而TGF~I可以促进PDGF受体 的表达，从而促进了PDGF对HSC增殖的作用，提示损伤因素激活KC，可启动HSC的增殖。因此，对于肝损伤早期阶段，如能抑制KC的活化，可避免HSC的活化，有可能减轻肝纤维化的发展。本实验观察了损伤肝KC对静止的HSC增殖的影响。结果表明，损伤肝KC对静止的HSC增殖有促进作用，Oxy可抑制活化的KC对HSC的旁分泌活化作用，并可抑制活化的KC分泌TGF~I。因此，在病变的早期给予Oxy治疗，特别是慢性病毒性肝炎，不但能起到抗病毒的作用，清除炎症刺激，且对肝纤维化的早期预防和治疗有重要的意义。
参 考 文 献
1 卢清，张清波，邬祥惠，等．氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响肝脏，2001，6：17?19
2 卢清，张清波，尹有宽，等．氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞产生转化生长因子Bl的影响中华医学实践杂志，2003，2：675．677．
3 汪谦．肝细胞、库普弗细胞和贮脂细胞的分离与培养．现代医学实验方法．第1版北京：人民卫生出版社，1997，158?162．
4 Seiicheiro K，Hidekazu T．Cytokine gene expression by Kupffer cells in experimental alcoholic liver disease．Hepatology，1995，21：1304?1309
5 Pinzani M ，Genyilini A，Callgiuri A，et a1．Transforming growth fac?tor?pl regulates platelet derived growth factor receptor p subunit in hu?man liver fat storing cells Hepatology，1995，21：232?238．
(收稿日期：2003?11?17)