丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

                                谢怡 尹有宽 张继明

                        XIE Yi   YIN You Kuan  ZHANG Ji Ming上海华山医院感染病科尹有宽

 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是单股正链RNA病毒，属黄病毒科丙型肝炎病毒属。全长约9．4kb，其序列为：341b的5’非编码区(5’URT)，编码3011个氨基酸的长开放读框，约27b的3’非编码区(3’URT)。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2／NS1)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)。由于RNA 复制酶的低保真性及缺乏校正功能，HCV 呈高度异质性；不同地区不同患者，甚至同一患者在不同病程中HCV分离株，无论是核苷酸序列，还是氨基酸序列均有显著差异 ll ll 1。本文就丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义作一综述：
1 HCV基因分型分类系统
自1991年Choo等分离出HCV完整的基因组后，在世界各地陆续发现一些HCV 分离株。对已经发表的HCV序列进行比较，发现不同基因型问全基因组序列存在显著差异。不同的研究者建立并使用各自的HCV分类系统，主要的命名系统有：
A：Chan或Simmonds系统：该系统根据病毒基因组核苷酸序列的同源性提出了HCV基因型分类命名系统。依据发现的先后顺序以阿拉伯数字对其进行编号，同一基因型中的不同亚型按其发现的先后顺序以小写英文字母对其进行标记。
B：Mori／Okamoto分类系统：在基因组全序列分析的基础上，用I、II、III、IV代表各种基因型，但没有考虑亚型的存在，不能反映各型问的差异程度。
B：Kanazawa命名系统：Enomoto最早开展HCV基因分型研究工作，将最早在美国发现的HCV基因型称为原型(Proto【ype，PT)或美国型(HCV?US，HCV．1)， 日本株则称为K2a或K2b。
研究者使用不同的分类系统，采用不同的分类方法，致使命名混乱，缺乏统一的鉴定标准，无法比较和借鉴其它实验室的研究结果。因此，第二届HCV与相关病毒国际讨论会议上，制定了统一的命名系统一Simmonds系统【41，与以往的命名系统有大致的对应关系(见表1)，己广泛用于此后的HCV基因型和亚型的研究中。
表1 HCV基因不同分类系统的比较
  一： 未分类
目前认为主要有6种HCV基因型和多种亚型，不同基因型问全基因组序列差异达35％；在各亚型问的差异约在75％ 一86％ 。2 基因分型的地理分布HCV 基因型与亚型在世界各个地区间存在着相对流行差异。1a和1b型在美国和欧洲是常见的基因型；在日本，1b型占HCV 感染的73％；2a和2b型在北美、欧洲和日本多见：2c型在意大利北部多见：3a型在欧洲和美国的吸毒者中流行；4型在北非和中东流行；5型和6型局限在南非和香港；7、8和9型仅在越南患者中提取出来；10型和l1型见于印度尼西亚患者。一些研究者认为7至l1型是6型的变异体  我国大陆仅有lb和2a两型，[1以lb型为l丰。往南方‘城市(南京、南宁、成都)，lb型占90％以_卜；而北方城市(哈尔滨、沈阳、兰州)，2a犁占46％~70％。基因型多样性不如香港、台湾及日本，但混合感染率明显高于其他 家和地区。
3 HCV 基因分型方法
3．1 基因分型的分子学方法 随着对HCV基因分型的地理分布差异、疾病表现差异、对治疗反应差异的深入讨论，建立一种可靠的HCV基因分型方法成为临床研究的重要课题。HCV基因分型标准且准确的方法是，将来自患者的HCV基因组用PCR方法进行扩增，并对其进行测序及种系分析。但是，这种直接测序方法的工序太复杂，用于普查是不可行的。
3．1．1 型特异性引物PCR 法 主要对来源于临床标本的HCV RNA进行扩增。然后，用带有特异性的引物或特异性探针进行再次扩增。Okamoto等人是首次使用特异性引物进行HCV基闶分型，所用引物是针对核心片段具有特异性。这种方法仅能检测出la、lb、lc、2a、2b和3a型；经修饰可增加敏感性和特异性，但是与其他方法间的效益差异尚不明确。
3．1．2 限制性片段长度多态性分析(RFLP)法对来源于临床标本的HCV RNA进行扩增。使用能识别特异性基因位点的核酸限制性内切酶进行酶切。这种方法是用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将PCR扩增的片段切割成不同长度的片段。
31_3 线探针杂交法(LIPA) 比利时Innogenetics(Zwijndre)研制出一种用于HCV基因分型的试剂盒(InnoLipa)，是针对5’非编码区的型特异性探针进行分型。现已广泛用于临床。由于5’非编码区相对保守，对某些亚型的区别较差。最初的InnoLipa试剂盒敏感性较低，不能辨别5％～10％la和lb病例，也不能辨别2a和2b。新版本的试剂盒能够区分HCVla、lb、2a～2c、3a～3c、4a～4h、5a和6a【 。
表2 HCV基因分型试剂盒比较
Table 2 Comparison of different reagent kits of HCV genotyping
3．1．4 系统进化树方法 1993年，Simmons提出系统进化树方法对全基因组进行比较，显示基因同源性在不同型为56％～72％，亚型间为74％～86％；除可鉴别几乎所有已知的基因型和亚型外(见表2)[61，还可发现新的型和亚型。选择NS5b区PCR扩增后行进化树结构分析是目前公认的基因分型“黄金标准”【2】。所有这些方法都能正确辨别主要的基因型组别，但只有核苷酸的直接测序在区分亚型中是有效的"】。而且，这些基于PCR方法的分型方法都具有其缺点和优点。型特异性引物PCR法和RFLP法的敏感性和特异性稍差。LIPA法对某些亚型不能区别。系统进化树方法费时、要求有专门的设备保证结果的精确性并且要注意防止污染。在临床实际应用中，可将各种方法结合使用，以起到互补作用。
3．2 基因分型的血清学方法 研究者分离出一种能作为HCV 基因分型(血清分型或血清学基因分型)的间接证据的基因型特定抗体。血清学基因分型的优点使之适合于大规模的流行病学研究。这些优点包括污染的风险小，实验方法简单。然而血清学分型缺乏敏感性和特异性，有其局限性。1989年，Kuo等应用HCV重组抗原(Cl 3)建立了第一种血清学分型方法即放射免疫法(RIA)。该方法具有放射性污染且操作繁琐，不久被EIA及RIBA取代。
3．2．1 重组免疫印迹试验(RIBA) 由Chiron Corp报道的RIBA SIA方法，用从NS4片段来源的5段血清学特异性多肽序列和来源于HCV基因组核心片段的2段血清学特异性多肽序列，区别HCV 基因型1、2和3型。
3．2．2 酶免疫试验(EIA) 由Murex提出的HCV血清分型酶免疫实验，由NS4编码的多肽诱发的基因型特异性抗体可区分基因型1～6型。对这两种方法进行比较，对于基因型1、2和3型的辨别有96％的一致性。血清学方法不能检出是否是近期感染，但对于保存不当、RNA 降解的血清或病毒败血症被清除的
血清，不失为一种合适的方法。在对大量的样品进行分析，如检测HCV传播途径、某一地区流行的型别时，如用血清学分型方法则快速简便、用量少，常规实验室就可操作 】。Beld等人研究显示，感染la型的具免疫活性的个体中，RIBASIA血清学分型方法具有高度可靠性。然而，这种方法对基因型3a型及合并HIV 感染的病例中敏感性低提示该方法有局限性，特别是在la型不普遍的地区。同样地，Songsivilai
 等人提出这种方法对感染了HCV基因型6型患者的敏感性差。美国学者认为，血清学基因分型与分子学基因分型具有高度一致性。而这些实验可靠性的差异是由于HCV 基因分型存在着地理分布差异。对HCV 分型方法的选择应根据专业实验室或机构的目的，若要识别所有的亚型或判断是否存在新序列，应该选择PCR扩增，然后进行测序。不过，针对治疗的实验，可选用上述任何方法，只需将感染了HCV l型患者与感染其他类型患者区别开来。
4 HCV基因分型的临床意义
4．1 流行病学标志HCV基因分布存在着地理差异，因此当HCV在人群中爆发时，基因分型可作为追查其根源的有效工具。HCV 主要传播途径是直接与患者血液接触，通过对不同人群HCV分子学研究，使包括垂直传播与性传播在内的HCV其他传播途径受到广泛关注，并证实HCV可在结肠镜检查时于患者一患者问传播。Zein等人发现HCV基因分型与所选择的研究对象没有关联，但不少研究者证实了这种关联  他们指出，3a型和la型在静脉药瘾者中多见，lb型多见于HCV 血制品传播中。从而证明基因分型对追踪HCV流行来源有重要意义。
4．2 HCV 感染的诊断通过对献血员检测血清中抗HCV抗体进行筛选，是目前阻止HCV传播的主要方法，但这种筛选的成败关键依赖于不同分离株问序列变异的程度。第一代HCV检测抗原由HCV基因1型NS4区编码的5?1?1、C。00．组成，不与其交叉反应的基因型可被漏检。第二代HCV检测抗原，增加了比较保守的C区抗原。第三代试验在二代的基础上增加了NS5区的抗原；从而，大大提高敏感性和特
异性，降低基因分型的影响【】”。HCV RNA逆转录PCR扩增已经渐渐成为HCV感染诊断和患者个体化治疗所必需的试验fl ，其主要优点包括对急性感染和病毒血症的早期诊断，但其敏感性受到引物选择及
标本处理的影响。对血清中HCV 病毒血症水平的定量分析已用于对于扰素治疗的患者选择及疗效评价。目前主要有两种的评价HCV RNA 方法；一是Roche建立的诊断系统，它是基于HCV RNA 定量的竞争性PCR；另一种是基于对特定的变异目标进行再次扩增。这两种方法均可对HCV RNA进行定量分析，具有可靠性和可重复性。
4．3 急性HCV 感染的转归感染了HCV 后，绝大多数(80％)患者不能自行清除，而发展为慢性肝炎。Amoroso等人 研究了基因分型在急性感染转变成慢性HCV中的作用，发现92％1b型急性感染患者会进展为慢性化，而其他类型仅35％~50％。而这一现象已成为研究的焦点【】 。有人认为，细胞免疫和体液免疫是自行清除的关键，但尚未被论证。也有人认为，可能是病毒基因高度变异发生免疫逃避，或者是病毒滴度低引发机体CTL细胞反应太弱。
4．4 与肝脏疾病严重程度的关系HCV基因分型与肝脏疾病严重程度的关系目前尚无定论。有文献报道认为，在慢性HCV 患者中，lb 型的肝脏病变较其它类型更严重：Kim13】等人发现101位住院患者中lb型占39．9％。Reid等人也发现在28位肝细胞癌患者中1b型有19人(68％)，其余患者通常是包括lb型在内的混合感染。lb型HCV致病性较强的可能机制是：①E基因区另有一高变区，随时间推移其突变率增加3-4倍，使病毒有可能逃避宿主的免疫监视；② 表达或编码的蛋白有较强的细胞毒作用。但是，由于基因分型不能从诸如病毒载量、饮酒、病程等影响肝脏疾病进展的其他协同因素中区别开来，作为独立因素，故无法开展前瞻性研究。也有研究者对上述观点进行驳斥。报道中指出n ：HCVlb型患者比其它分型的患者年龄大，而且比其它分型早出现，认为HCV lb型HCV肝脏病变严重，是因为它存在着较长的感染期，而非对肝脏具有更强的破坏。而Ortiz等人’ [161[" 认为，肝硬化主要与感染HCV病毒时患者的年龄、性别、ALT水平及长期饮酒(>50 g／day)关系密切。至于lb型与肝细胞癌的关系，需进～步研究包括建立体内、体外HCV复制和蛋白表达模型等。
4．5 对干扰素治疗的应答 自从发现HCV以来，对预测干扰素长期应答相关因素的发现是一重大贡献。多项临床研究表明，对a一干扰素抗病毒治疗应答性有影响的常见因素包括年龄、病程、肝硬化、基因型和HCV RNA血清水平。多元分析表明 博1f J9]，lb型、高水平的HCV RNA是唯一对a一干扰素治疗无应答的独立性预测因子。普通Q一干扰素治疗24周，2型的患者对于扰素的完全应答占60％．70％，
而1型患者仅占10％．15％。Peignoux等对法国141例慢性丙型肝炎经a一干扰素治疗的研究中表明，lb型的持续有效率最低仅为4％，非lb型达32％；特别是3a型的持续有效率高达38％。长效干扰素(即聚乙二醇化干扰素，PEGASYS)对丙型肝炎患者的疗效明显优于普通a一干扰素，但在各基因型中也存在差异。Perry 等报道 ，HCV 基因型1型对PEGASYS治疗的持久病毒学应答率为28％，而基因型2／3型患者中持久病毒学应答率为56％。在日本，对lb型患者的研究中发现在HCV基因组的非结构区存在“干扰素敏感片段(ISDR)”，Dig等人【2l1研究发现ISDR可能位于NS5A区；但欧美和我国研究中并未发现这一基因片段 丝】㈣。这一发现的意义尚不清楚。
4．6 HCV 基因分型与疫苗的研制HCV 基因序列的高度变异性，主要表现为病毒各种基因型、亚型、准种变异的存在和免疫逃避现象，使得病毒得以逃脱宿主免疫系统的作用而造成病毒的持续感染，同时给丙型肝炎疫苗的研制工作带来很大的困难【24]。在体液免疫和抗体研究中，HCV E区是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E区及其编码的抗原(包膜糖蛋白)是HCV疫苗研究的重点。但是，这种包膜蛋白在不同型别间存在高度变异。
5 结论
在全世界均可分离到HCV 的多种基因型，主要包括6种基因型和多种亚型。HCV基因分型是重要的流行学标志；可用于对HCV 的诊断；可能在HCV 急性感染慢性化中起重要作用；其与肝脏疾病严重程度的关系目前仍存在争议；不同的基因型对干扰素治疗的应答存在显著差异；来源于HCV 基因组高变区域的蛋白可诱发保护性免疫，对研制预防HCV的有效疫苗是个重要挑战。
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