RNA干扰抑制丙型肝炎病毒复制的研究进展

                                  王新宇 尹有宽 张继明

RNA干扰技术(RNAi)是近两年来产生的新兴生物技术。RNAi作用的基本原理是双链小干扰RNA(siRNA)结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上并切割mRNA，进而破坏特定目的基因转录产生的mRNA，使其功能沉默。由于siRNA作用的阶段是在目的基因转录成为mRNA以后，即转录后，所以RNAi引导的基因沉默又称转录后基因沉默(PTGS)。上海华山医院感染病科尹有宽
首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于秀丽杆线虫的研究.。之后的研究表明，dsRNA也同样能阻止哺乳动物基因的表达，但是siRNA大小必须小于30nt。最近的研究发现，RNAi可在数种不同的哺乳动物细胞中抑制多种病毒的复制。
一、目前丙型肝炎病毒(HCV)感染及治疗的现状HCV感染是慢性肝病最重要的病因之一，全球约有1．7亿人受到HCV感染，每年有300～4OO万的新发病例 J。我国也是丙型肝炎高发地区之一，HCV感染者约占总人【l的3．2％ 。急性HCV感染者中大约有80％的患者会成为慢性持续性感染者，其中20％的患者经历2O～3O年后可进展为肝硬化，1％ ～5％患者可进展为肝细胞性肝癌(HCC)。丙型肝炎已成为全球性的公共卫生问题，严重影响了社会和经济的发展。HCV是黄病毒家族中的一员，主要在感染者的肝脏中进行复制。HCV主要有6种基因型，每个型别之间都至少有超过30％的核苷酸序列差异。HCV基因型的原始株1a主要见于美国和北欧地区，而1b最初是在日本发现，现在已经呈世界性的分布。HCV是一条长约9．6kb的正链RNA，包括5 非编码区(5"-UTR)、开放读码框架(ORF)以及3 非编码区(3 一UTR)。由于HCV基因组是一条单链的RNA，其本身就是mRNA，所以HCV天生就是基于RNAi治疗的合适对象。
5"-UTR由341个核酸(nt)组成，在这个区域中核酸序列高度保守。而且即使在最相近的HCV亚型之间，其5"-uTR也不全相同。ORF翻译产生一条多肽链，它随后被加工成至少lO种不同的蛋白质，其中包括1种壳(核心)蛋白，2种包膜蛋白(El和E2)和5种非结构蛋白(NS2，NS3，NS4，NSSA和NSSB)。其中NSSB蛋白是一种RNA依赖的RNA多聚酶(RdRP)，它是HCV复制的关键酶。研究已经发现，NSSB协同NS3和NS4A产生一条RNA基因组的负链拷贝，而其又可以产生众多的正链RNA拷贝。
目前尚无针对HCV的疫苗。针对HCV感染的经典治疗方案是a干扰素联合利巴韦林，其治疗的病毒学应答率在40％ ～6o％之间。近年经l临床观察认为，聚乙二醇a干扰素与利巴韦林联合治疗为最佳治疗方案，其治疗的病毒学应答率高达60％～ 80％ ，不同的报道由于基因型的差别而有所不同。最近一种
NS3蛋白酶的小分子抑制剂(BILN2061)在临床研究中显示出优于干扰素或利巴韦林的疗效，但是该药物作为一种治疗HCV的标准治疗方法还为时尚早。 。在抗HCV的治疗中，一个很大的难题就是如何对付与准种同时存在的变异种群。准种是指在感染个体内循环的既有区别又相互关联的不同的病毒株。病
毒的异质性导致了NSSB基因编码的RNA依赖的RNA多聚酶的高错配率，而后者对于HCV的复制有着重要的地位。研究发现，5"-UTR比HCV的其它基因有着更高的保守性，如在HCV 1b 基因型的不同准种中，3O至170nt的序列是卜分保守的 。由于RNAi技术对于siRNA和靶序列之间的单个碱基错配都非常
敏感 ，看来5 ．UTR是针对HCV进行RNAi的最佳靶位。
二、RNAi抗HCV的研究
缺乏体外细胞培养模型一直是HCV研究的一个主要障碍。但最近，HCV亚基因组的复制子系统已经被开发出来 ’ 。这些复制子已经适应『突变，而且能够在细胞培养中有效的复制。它们缺少结构基因，因此不能产生有活性的病毒颗粒。利用亚基因HCV复制子系统，最近使用合成的双链RNA(dsRNA)已经成功抑制了HCV RNA在培养细胞中的复制。针对HCV基因组的特异性靶位见表l。Seo等 使用一种HCV RNA 基因组的复制子进行了RNAi研究，复制子中包含了一段新霉素耐药基因用于细胞株的筛选，一段荧光素酶基因用于监测复制子表达的水平。研究发现，当使用针对5"-UTR或者是荧光素酶的特异性siRNA转染细胞后，荧光素酶的水平下降了85％ ～90％ ，而非特异性的对照组siRNA和与荧光素酶靶位有3个核苷酸错配的siRNA则根本不能减少荧光素酶的水平。为了排除siRNA细胞毒性导致荧光素酶活性减低的可能，研究者同时还监测了细胞ATP水平，发现转染和没有转染的细胞均没有变化。Kapadia等 使用了一种包含HCV基因型1b型亚基因的复制子系统，siRNA针对的靶位是NS3和NSSB，在转染2 d后利用实时PCR测定，发现RNA水平分别有5．7和8．3倍的抑制。通过Western印迹法检测NS3和NSSB的蛋白水平，转染2 d后发现并没有变化，但是4 d后，开始出现了下降。这个现象提示这些蛋白质代谢的半衰期相当长。他们还比较了RNAi和IFN对于HCV的抗病毒效果，发现siRNA相比IFN，其抑制病毒复制的能力要强3倍，而且siRNA的抗病毒效应是独立于IFN的。
  表l 在已经进行的沉默HCV的研究中所采用的小靶位RandaU等 使用了一个相类似的RNA复制子系统，siRNA靶位针对5 UTR，利用实时PCR检测HCV RNA的水平，发现转染12 h后病毒水平下降5倍，转染96 h后病毒下降80倍。HCV RNA的水平在8 d后依然能够检测出。绝大多数的细胞在使用针对NS5A的抗体进行免疫荧光检测时，依然能够检测到蛋白。在siRNA处理过的细胞中对G418发生耐药的克隆明显减少，这些证据支持siRNA介导了在这个系统中抑制HCVRNA复制的过程。这项研究也显示了利用RNAi抑制HCV复制的高度特异性。当siRNA仅和靶序列有3nt的差异，就不能抑制病毒复制。Wilson等 选择了两条siRNA进行研究，靶位均为NS5B区，在转染72 h后进行Northern印迹法分析，发现HCV RNA的
水平下降了大约90％。同时，他们还应用免疫印迹的方法检测了NS3和NS5B区编码的非结构蛋白的表达水平，结果均为阴性。此后，他们又采用r一个基于质粒的表达系统来合成siRNA，这个质粒系统可以分别表达siRNA的正义链和反义链。他们利用电穿孔的方法将siRNA和HCV亚基因组同时导人细胞。3周后与对照组相比，发现G418耐药的克隆在siRNA表达的细胞中减少了70％ 。研究提示，通过RNAi长期抑制基因表达可以用这种方法来实现。Yokota等. 选择的5个靶位均是针对5 ．u rR区。他们发现，其中最有效的siRNA是siRNA．331，它在浓度为2．5 nmol时就成功抑制了81％的HCV复制，当浓度提高到125 mmol时，抑制的效率达到了94％。在此基础上，他们构建了一个DNA载体用以表达siRNA．331。他们分别使用了两种方式来构建载体，一种是串联的形式，把正义链和反义链分别置于U6启动子的下游，另一种是茎环形式的载体，在这种形式中正义链的3末端和反义链的5 末端通过一段9 nt的环状序列相连，同样也置于U6启动子的下游。两种形式的siRNA表达载体都抑制了HCV复制，但茎环结构与串联结构相比效率更高。Radhakrishnan等 ‘利用整合在VA1融合结构中的复制子，通过持续表达短发卡样RNA(shRNA)，成功地完全抑制了细胞中的HCV，这个结果是通过RT?PCR的方法检测到的。VA1是
一种腺病毒基因，先前曾经应用于核酶表达的研究 ，最近也用来表达shRNA ，但两者都只是在抗HIV的研究中采用，靶位也都是内源基因CCR5。VA1．shRNA融合的转录子主要存在于细胞质中 ，而对于被认为主要在细胞质中起作用的RNAi，其无疑占有优势。Sen等 在人类肝癌细胞系(HepG2)中针对HCV基因型1a型的NS5A区设计r siRNA，成功抑制了NS5A RNA和蛋白的表达。该研究通过内源性的a肌动蛋白和dsRNA激活的丝氨酸色氨酸激酶作为参照进行检测，发现两者的量并没有相应地减少，从而证实了siRNA的病毒抑制作用。研究还发现，siRNA还有效地抑制了NS5A介导激活的IL_8启动子。Kronke等“ 为了避免基因型之间以及准种之间的差异而造成的RNAi失败，制定了两种不同的方案来进行研究。首先，他们使用lr Dicer酶产生siRNA，这样产生的不同siRNA针对了病毒基因组的不同区域，从而避免了siRNA高度特异性造成的局限，并且成功地抑制了HCV复制子在细胞内的复制。此后，他们又使用逆转录病毒作为载体来制造shRNA，一共选择了l2个区域，其中大部分都位于5 V rR这一高度保守的区域。研究发现，只有在第Ⅳ域及其附近选择的靶位才能够比较理想地抑制病毒复制子的复制。Takigawa等 也使用了质粒表达(pAVU6+27)和含有pAVU6+27表达框架的慢病毒来进行RNAi的研究，他们发现上述的两种方法对于HCV．1b型的NS3和NS5B靶位的RNAi都取得了比较理想的效果，而且这两个区域同5 UTR相比都取得了更加好的抑制效果。
这些研究结果都表明，利用RNA在复制子系统中抑制HCV是可行的，而且在这个系统中靶位的选择也并不困难。研究者还提出了这样一个问题，HCV感染的靶细胞含有RNAi所需要的所有组分，但是在正常的感染过程中，HCV为何并不能诱导RNAi反应。一个可能的解释是，在体内，HCV抑制了依赖Dicer的长dsRNA裂解成为大约2lnt大小siRNA这一过程 ’ 。RNAi也已经有效地沉默了成年小鼠体内HCV NS5B基因的表达。这个研究中HCV的NS5B基因与荧光素酶基因融合，并在小鼠的肝脏中表达 。设计针对HCV NS5B区的siRNA或者是siRNA表达质粒通过水动力转染的方法导入小鼠的肝脏，然后检测荧光素酶的量。化学合成的siRNA抑制了大约75％的荧光素酶表达，而基于质粒的siRNA成功抑制了98％ 的荧光素酶 。
三、RNAi遇到的困难及未来
初步研究表明，基于RNAi的抗HCV治疗是有效的，然而依然有很多问题等待解决。其中最突出的问题包括给药的方式、耐药与病毒逃避 。RNAi对于靶区域的错配有着极高的敏感性。研究显示，即使是一个碱基的错配也可能导致RNAi活性的丧失 ，因此RNAi用于治疗时，另一个严峻的问题是病毒只要发生一个碱基的变异便能产生耐药。在HCV方面，这个问题显得尤为突出，HCV中RdRP由于缺乏校读功能，当其复制时会产生大量的错误。这类问题也已经在脊髓灰质炎病毒RNAi的研究中观察到“ 。近来在H1V的研究中这类问题出现得更多 20]。另一个可能出现的问题是当不能完全抑制病毒时，残余的病毒可能会反跳。以慢性丙型肝炎患者为例，通常患者血液中的病毒载量在l 05～l0 基因组拷贝／ml之间，也就是说，即使RNAi治疗成功地抑制了90％的病毒RNA，残余的病毒依旧足够利用靶区域的突变而产生耐药。这样，同时选择多个靶位的混合siRNA或者RNAi协同如核酶以及反义核酸技术作为一种联合治疗的手段来对抗病毒可能会取得更好的疗效。
总之，RNAi作为一种崭新的抗病毒技术，在已经进行的体外和体内研究中得到了比较理想的效果，但是目前离临床应用还有一定差距，还需要研究者在有效性、持久性和安全性等方面进行更深入的研究。
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  中华肝脏2005年3月第10卷第一期