上海地区145 例慢性乙型肝炎患者HBV 基因型与α22b 干扰素疗效关系的初步探讨

                  中国抗感染化疗杂志2005 年6 月30 日第5 卷第3 期

      上海地区145 例慢性乙型肝炎患者HBV 基因型与α22b 干扰素疗效关系的初步探讨上海华山医院感染病科尹有宽

              王新宇, 　尹有宽, 　谢　怡, 　张清波, 　邬祥惠, 　张继明
摘要: 　目的　调查上海地区慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒( HBV) 基因型分布状况,研究α22b 干扰素疗效与患者HBV 基因型的关系。方法　用特异性引物PCR 的方法鉴定上海地区145 例乙型肝炎患者的HBV 基因型。对其中符合抗病毒治疗标准的22 例患者以α22b 干扰素进行治疗并观察疗效,疗程24 周。分别在治疗前、治疗后12 、24 周进行血清生化学和病毒学的检测。结果　145 例乙型肝炎患者中HBV 基因型B 型占60 % ,C 型占36. 6 % ,B、C 混合型仅占3. 4 %。接受α22b 干扰素治疗的22 例患者中,感染HBV 基因型B 型的患者33 %取得了治疗联合应答,而C 型仅为7 %。结论　上海地区HBV 基因型流行以B 型为主,其次为C 型,B、C 混合型较少见。本研究发现B 基因型接受α22b 干扰素的应答率比C 型为高,与文献报道相仿,但经统计学检验差异无显著性,值得进一步加以研究证实。
关键词: 　乙型肝炎病毒; 　基因型; 　聚合酶链反应; 　α22b 干扰素
中图分类号:R373. 2 　　文献标识码:A 　　文章编号:100927708 (2005) 0320160205
Prel iminary study on the relationship between HBV genotypes and the effect of in2 terferon alpha22b in 145 patients with chronic hepatitis B in Shanghai
WA N G X i n2y u , 　Y I N You2k uan , 　X I E Yi , 　Z HA N G Qi ng2bo , 　WU X i ang2hui , 　Z HA N G J i2mi ng .( Dep artment of I nf ect ious Diseases , Huashan Hos pi t al , Fu dan Uni versi t y , S han g hai 200040 , Chi na)
Abstract : 　Objective This study was designed to investigate the dist ribution of HBV genotypes in patient s with chronic hepatitis B (CHB) in Shanghai and explore the relationship between HBV genotypes and the efficacy of interferon alpha22b.
Methods HBV DNA genotypes were identified in 145 CHB patient s by PCR method with specific primers. Twenty2two patient smeeting the criteria of antiviral therapy were t reated with interferonα22b for 24 weeks. The biochemical , immunological and virological parameters were evaluated at baseline , week 12 and week 24. Results Of the 145 CHB patient s , 60 % had HBVgenotype B , 36. 6 % genotype C , and 3. 4 % had both genotype B and C. In the 22 patient s t reated with interferonα22b , 33 %of the patient s with HBV genotype B achieved combined response. Only 7 % of patient s with HBV genotype C obtained the same result . Conclusions HBV genotype B is the major HBV genotype in Shanghai. HBV genotype C is less than genotype B. Co2existing genotype B and C is found occasionally. The patient s infected with HBV genotype B may have better t reatment response than genotype C patient s.
Key words : 　Hepatitis B virus ; 　Genotype ; 　Polymerase chain reaction ; 　Interferon alpha22b
　 1988 年Okamoto 等[ 1 ] 根据乙型肝炎病毒( HBV) DNA 核苷酸序列差异大小对HBV 进行分类的方法来代替传统的血清亚型分型方法。10 余年来,这一观点已被广泛接受,并且越来越多的研究表明HBV 的基因分型与HBV 感染的转归、α22b干扰素的疗效等有着密切的关系。本研究鉴定上海地区145 例慢性乙型肝炎患者HBV 基因型,并分析HBV 基因型与患者血清学、病毒学指标以及与α22b 干扰素的治疗效果之间的关系,现将结果报道如下。
  材料与方法
一、病例来源
患者皆为2002 年2 月至2003 年1 月间在我院肝炎门诊就诊的慢性乙型肝炎患者,诊断符合2000年(西安) 全国病毒性肝炎学术会议制定的诊断标准。研究共入选患者145 例, 其中男123 例(84. 4 %) ,女22 例(15. 6 %) ;年龄18～55 岁(平均36 岁) ;平均病程3. 5 年(7 个月～20 年) 。对所有符合标准的145 例患者的血清进行了HBV 基因型分型鉴定。
二、抗病毒治疗入选条件及治疗方法
145 例中有22 例符合α22b 干扰素治疗条件,入选条件皆具以下标准:丙氨酸转氨酶(AL T) 升高在正常值上限(ULN) 2 ～10 倍; 乙型肝炎e 抗原( HBeAg) 、乙型肝炎表面抗原( HBsAg) 阳性以及HBV DNA 阳性( ≥105 拷贝/ ml) 。怀孕期妇女,6个月内接受过拉米夫定或α22b 干扰素治疗的患者以及对α22b 干扰素过敏者皆被排除。入选者常规接受α22b 干扰素治疗,剂量为3 MIU/ 次,每周3 次皮下注射。入选患者治疗持续24 周,并在治疗前、治疗后12周和24 周进行血清生化学和病毒学的检测。
三、血清生化学及病毒学指标检测
HBV DNA 定量检测采用荧光定量PCR 方法( Taqman) ,HBV 抗原抗体采用美国Abbot t 公司生产AXSYM 全自动免疫分析系统及配套试剂进行检测,AL T 等生化指标由我院检验医学中心检测。
四、引物特异性PCR 的HBV 基因型鉴定方法
(1) 每例筛选患者在筛选时留血5 ml ,2 000 r/min 离心10 min 后,留取上层血清, - 70 ℃冻存待检。(2) 血清DNA 抽提方法为酚2氯仿提取法: 取患者血清100μl 加入300μl TES 中,再加入蛋白酶K(Merck ,USA) 5μl ,65 ℃水浴3 h 。再加入饱和酚200μl 和氯仿200μl ,充分混匀后,12 000 r/ min 离心20 min ,抽提水相。加入1/ 10 体积3 mol/ L 乙酸钠和2 倍体积无水乙醇和3μl 糖原(Sigma ,USA) ,- 20 ℃静置过夜。将过夜的样品0 ℃13 000 r/ min离心10 min 后,弃去上清。空气中放置5 min 自然干燥后,沉淀用TE(p H 8. 0) 液20 μl 溶解, - 20 ℃保存。(3) PCR 引物设计及原理:参考Naito 等[ 2 ] 、Kirschberg 等[ 3 ] 文献资料,使用Primer5 . 0 、Oligo软件设计、评价引物。先进行第1 轮PCR ,扩增出全长的S 基因,再根据不同基因型在某些位点具有特征性序列的特性选用不同引物,进行第2 轮的两组多重PCR ,扩增出长短不同的PCR 产物片段,利用琼脂糖水平电泳分离,从而达到鉴别基因型的目的。理论上通过第2 轮PCR 便可以鉴定A～F 的6种HBV 基因型。所有PCR 引物和测序引物均由上海博亚生物技术有限公司进行合成(见表1) 。
表1 　特异性PCR HBV 基因分型方法PCR 引物和S 基因测序用引物列表
Table 1. 　Primer sequences used for HBV genotyping by nested PCR and S gene sequencing Name Sequences Description
First round PCR S1 5′> GTCACCATATTCTTGGGAAC < 3′ Amplify PreS1/ PreS2/ S gene primers AS 5′> CATATCCCATGAAGTTAAGG< 3′
Second round PCR P11 3 5′> GGCTCMAGTTCMGGAACAGT < 3′ Genotypes A2E specific primers P12 5′> CTCGCGGAGATTGACGAGATGT < 3′ Genotype A specific
Mix A( P112P14) P13 5′> CAGGTTGGTGAGTGACTGGAGA < 3′ Genotype B specific
P14 5′> GGTCCTAGGAATCCTGATGTTG< 3′ Genotype C specific
Mix B( P152P18) P15 5′> GCCAACAAGGTAGGAGCT < 3′ Genotype D specific
P16 5′> CACCAGAATCCAGATTGGGACCA < 3′ Genotype E specific
P17 5′> GYTACGGTCCAGGGTTCACA < 3′ Genotype F specific
P18 3 5′> GGAGGCGGATYTGCTGGCAA < 3′ Genotypes D2F specificSequencing primers S1 5′> GTCACCATATTCTTGGGAAC < 3′
S3 5′> TTCCTGCTGGTGGCTCCA < 3′
S4 5′> TATGTTGCCCGTTTCTCCTCT < 3′
3 tide. “M”represent s a nucleotide t hat could be eit her an A or a C;“Y”represent s a nucleotide t hat could be eit her a C or a T. nt , nucle2otide.
 五、2 轮PCR 以及电泳条件
以我室构建的HBV 全基因质粒(基因型C 型)为阳性对照,以双蒸水( ddH2 O) 为阴性对照,进行PCR。取从血清抽提得到的DNA 溶液5 μl 作为模板,加入Premix Taq 酶25 μl (宝生物技术有限公司,大连) ,并加入浓度为10 μmol/ L 的PCR 引物S1 、AS 各2μl ,加ddH2O 补足至50μl ,进行第1 轮PCR。热循环仪( PT2100 , MJ Research , USA) 程序设置为95 ℃10 min ,随之以35 个循环的94 ℃30s ,55 ℃45 s ,72 ℃1 min ,最后72 ℃5 min 。然后再取0. 5μl 第1 轮PCR 产物作为模板,使用与第1 轮相同的Premix Taq 酶,进行第2 轮PCR。热循环仪程序设置为95 ℃ 10 min ,随之以20 个循环的94 ℃20 s ,58 ℃20 s ,72 ℃30 s ,再跟之以20 个循环的94 ℃20 s ,58 ℃20 s ,72 ℃30 s ,最后72 ℃延伸5min 。取5μl 第2 轮PCR 产物上样电泳,电泳介质为30 g/ L 琼脂糖,溴乙锭( EB) 染色后紫外成像仪(复华,上海) 观察并拍摄电泳结果。根据电泳结果中不同基因型的PCR 产物电泳移动的不同位置来判定HBV 基因型(见图1) 。
图1 　部分样品第2 轮PCR 产物3 %琼脂糖电泳结果
FIG. 1. 　3 % gel loaded wit h part of t he scecond round PCR product s
M ,Marker ( Takara , DNA Marker 2 000) ;1 , Negative Cont rol ; 2 , Genotype C Contorl ;
3 , Genotype B Cont rol ; 5 ,8 , Genotype B Sample ; 4 ,6 ,7 ,9 ,10 , Genotype C Sample.
　　六、HBV DNA S 基因测序
随机选取20 份第1 轮PCR 产物送上海博亚生物技术有限公司进行测序(测序引物见表1) 。测序结果使用Vector N TI 软件进行辅助连接、比对,使用TreeView 软件进行进化树构建,从GenBank 中下载已经发表的HBV DNA 全基因序列(已知基因型) ,作为构建基因树的参考序列。
七、疗效评价与统计分析
治疗效果评价的指标包括在治疗24 周到治疗结束时患者HBeAg 阴转, HBV DNA 抑制(低于105 拷贝/ml ) ,AL T 正常,血清学转换( HBeAg 阴转,同时抗2HBe 阳转) ,以及治疗联合应答[ 4 ] (包括HBeAg 阴转,HBV DNA 抑制和AL T 复常3 项指标同时出现) 。对于不同HBV 基因型血清生化学即病毒学指标的比较采用单因素方差分析的方法进行统计检验并进行两两比较,统计软件为Stata 。
结　　果
一、患者血清病毒学指标检测结果
145 例患者检测HBsAg 滴度和HBV DNA 值 结果如下: HBsAg 定量结果平均337. 38 ±85. 71(S/ N) ; HBeAg 定量结果平均137 . 08 ±104. 65 ( S/CO) ; HBV DNA 值平均1. 32 ×108 (拷贝/ ml) 。
二、特异性引物PCR HBV 分型方法分型结果
145 例筛选患者特异性引物PCR HBV DNA分型方法结果为B 型87 例(60. 0 %) ,C 型53 例(36. 6 %) ,B、C 混合型5 例(3 . 4 %) 。
三、S 基因测序结果与特异性引物PCR 两种HBV 分型方法结果的比较随机选取20 个第1 轮PCR 产物测序并拼接后得到20 条S 基因序列,与已知基因型的从Gen2Bank 下载的S 基因共同构建进化树。结果发现S基因测序与PCR 电泳2 种基因分型结果的比较完全一致,因此我们认为特异性引物PCR 与S 基因测序鉴定HBV 基因型的方法同样可信。
四、患者基因型与治疗前血清病毒学指标关系的分析
研究发现基因型B 型HBsAg 定量结果明显高于C 型,两者差异有显著性( P < 0 . 01) 。研究还提示B、C 混合型的患者HBsAg 定量结果似乎比B 型更高,但由于样本数少,两者间差异无显著性。研究还发现两组间HBeAg 定量结果以及HBV DNA 值比较结果基本相同,差异均无显著性。(见表2 ,图2)
 表2 　不同基因型HBsAg ,HBeAg ,HBV DNA 定量比较
 图2 　不同HBV 基因型HBsAg 定量结果比较
FIG. 2. Quantitative hepatitis B surface antigen( HBsAg) level by different HBV genotypes
　　五、24 周治疗结束时的疗效评价
在24 周治疗结束时,22 例接受α2干扰素治疗的慢性乙型肝炎患者HBeAg 阴转率为31. 8 %(7/22) ,血清学转换为31. 8 %(7/ 22) ,HBV DNA 抑制率(低于105 拷贝/ ml) 为45. 5 %(10/ 22) ,AL T 正常率为68. 2 %(15/ 22) ,治疗联合应答率为13 . 6 %(3/22) 。
六、治疗前HBV 基因型等指标与近期疗效的关系
本研究也对治疗前患者各项血清检验结果与预后的关系作了研究。在治疗前HBV 基因型为B 型的患者中取得治疗联合应答的比例为33 % ,而C 型仅为7 %。在治疗前AL T 水平≥2 ×ULN 的患者发生血清转换和联合反应的比例也要高于AL T 水平< 2 ×ULN 的患者。治疗前HBeAg 定量检测发现若低于100 ( S/ N) 则可以获得更好的治疗反应。我们发现治疗前HBV DNA 定量较低的患者也能够获得较好的联合治疗反应(17 %对10 %) 。但是本研究入选治疗的病例较少,以上比较结果经Fish2er 的确切检验差异无显著性(见表3) 。
表3 　治疗前患者HBV 基因型、AL T、HBV DNA 及HBeAg 定量结果与治疗24 周患者联合应答率的关系
 　　
讨　　论
目前比较成熟的HBV 基因型鉴定方法大致可以分为以下几类:测序、限制性片段长度多态性分析(RFL P) [ 526 ] 、特异性引物PCR[ 223 ] 、线性探针杂交[ 7 ]等,上述方法各有利弊,其中全基因测序方法是公认
的金标准, 但是全基因测序成本过高, 而PCR、RFL P 等方法都只能鉴定已知的基因型,有一定的局限性。Norder 等[ 8 ] 发现除了P 基因测序之外,S基因测序与全基因测序结果符合率最高,并且相对降低了分型的成本,值得推荐。采用测序方法进行基因型鉴定也便于发现新的基因型和新的有意义突变位点。
从我国乙型肝炎基因分型分布情况来看,HBV基因型主要以B、C 两种类型为主,其中北方地区C型更为多见[ 9 ] 。在本研究,我们发现上海地区乙型肝炎患者HBV 基因型主要也是B 型和C 型,其中以B 型为主,偶见B、C 混合型的病例,没有发现其他基因型。
Sugauchi 等[ 10 ] 发现,基因型B 型和C 型的患者,其前S 区发生缺失的比例有明显差别,他认为这也是C 型发生重型肝炎的比例高于B 型的原因。
本研究发现HBsAg 定量结果在基因型B 型和C 型间差异有显著性,分析原因,可能是基因型C 型发生前S 区变异、缺失的比例较B 型高,而前S 区的碱基缺失造成了HBsAg 翻译及合成的障碍。我们推测这是HBsAg 定量结果基因型C 型低于B 型的主要原因。本研究在测序的18 条S 基因PCR 产物片段中,有2 条发生了前S 区部分缺失,分型结果表明两者均为基因型C 型,也符合这个推测。2 种型别之间HBeAg 定量结果差异无显著性,该结果与Kobayashi 等[ 11 ] 的研究结果并不一致,有待进一步研究。
对于α22b 干扰素治疗慢性乙型肝炎患者的应答率,Thomas 等[ 12 ] 发现欧洲西北部的患者能够比东南亚的患者取得更好的疗效。Kao 等[ 13 ] 在回顾性研究中发现HBV 基因型C 型使用α22b 干扰素治疗疗效要比基因型B 型差。Nakayoshi 等[ 14 ] 在最近的研究中发现基因型B 型患者HBeAg 的清除率要高于基因型C 型的患者,而基因型B 型患者肝硬化的发生率却要高于基因型C 型患者。本研究结果提示,使用α22b 干扰素治疗慢性乙型肝炎,基因型B 型患者较C 型可能会有着较高的治疗应答率和血清转换率。
本研究发现治疗前较高的AL T 水平、较低的HBeAg 水平、基因型B 型以及较低的HBV DNA病毒载量都可能是获得较好的治疗应答的预测因素。这与Cooksley 等[ 4 ] 的研究结果基本一致。本研究结果中,各预测因素经过Fisher 精确检验没有统计学差异可能和接受α22b 干扰素治疗的病例数较少有关。
自Okamoto 等[ 1 ] 根据全基因序列测序结果建立HBV 基因分型方法以来,已经先后发现了8 个基因型,本研究发现上海地区流行的HBV 基因型以B 型和C 型为主,并且发现B 型较C 型有着较高的HBsAg 水平,两者差异有显著性。研究结果还提示α22b 干扰素对基因型B 型的抗病毒应答率较C 型为高,但经统计学检验差异并无显著性,值得进一步加以研究证实,以利作为临床应用α22b 干扰素治疗慢性乙型肝炎的参考。
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基金项目:上海市科技攻关计划项目(编号:034119906) 。
　作者单位:复旦大学附属华山医院传染病科,上海　200040 。
　作者简介:王新宇(19772) ,男,住院医师,在读硕士研究生,主要从事病毒性肝炎的抗病毒治疗研究。
 　通讯作者:尹有宽,E2mail :annerain2000 @yahoo. com. cn 。

收稿日期2004212213