VEGFR-2在肿瘤血管生成中的作用的研究进展

VEGFR-2在肿瘤血管生成中的作用的研究进展

曾辉

武汉市第一医院肿瘤科 430022

［摘要］   新生血管生成(angiogenesis)是指从预先存在的毛细血管以出芽方式形成新的血管的过程。人体的多种生理和病理过程都涉及了新生血管生成包括胚胎发育、月经周期、伤口愈合、肿瘤、风湿性关节炎和糖尿病视网膜病变等。而在新生血管生成的过程中，血管内皮生长因子受体－2（Vascular endothelial growth factor receptor ? 2，VEGFR - 2)起着及其关键的作用。本文就VEGFR ? 2的结构、功能、在信号转导中的作用及可能的应用前景作一介绍。对VEGFR ? 2的深入了解，有助于我们设计包括新生血管生成在内的生理和病理过程的干预策略。江汉大学附属第三医院肿瘤科曾辉

［关键词］  血管生成；血管内皮生长因子；受体

人体的多种生理和病理过程都涉及了新生血管生成(angiogenesis) ,包括胚胎发育、月经周期、伤口愈合、肿瘤、风湿性关节炎和糖尿病视网膜病变等。新生血管生成是指从预先存在的毛细血管以出芽方式形成新的血管的过程^［1］。这一过程是由多种因子来激发和调控的^［2］,包括碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF) ,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF) ,血小板衍生生长因子(platelet - derived growth factor , PDGF), 血管生成素-1(angiopoietin-1),肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF),转移生长因子-β(transforming growth factor -β,TGF -β),白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)等。其中,VEGF 是目前发现的最为强大和专一的刺激内皮细胞增生的因子,除此外,它还有增加血管通透性,趋化血管内皮细胞等功能^［3－5］。迄今,已发现的VEGF 信号转导的主要受体包括fms 样酪氨酸激酶VEGFR-1 ,即Flt- 1 (Fms?like tyrosine) ,胎儿肝激酶插入区受体VEGFR - 2 ,即KDR/ Flk- 1( Kinase insert domain- containing receptor) 和VEGFR - 3(Flt-4) ,三者均具有酪氨酸活性，此外还有一些相关受体,如神经纤维网蛋白(Neuropilin-1,2 ,NRP -1 ,2) 等非激酶受体。其中,VEGFR -2 主要分布在血管内皮细胞,也分布在造血干细胞、巨噬细胞等^［5］。它的主要作用是介导VEGF 的血管内皮细胞增生,趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能,因此,是VEGF 的主要功能受体^［3－5］。深入理解VEGFR - 2 的结构与功能以及它在新生血管生成过程中的调控机制有利于理解相关病理生理现象,并对相关疾病的治疗起指导作用。目前关于VEGFR- 2 功能结构与信号转导调节在肿瘤血管生成的研究已有了很大的进展,本文就这方面的研究进展作一综述。

    1 VEGFR-2 的结构

　      人VEGFR -2 又名激酶插入区受体( kinase domain receptor , KDR) ,其编码基因位于4q12 ,编码了1356个氨基酸。是一分子量为230 kD 的跨膜糖蛋白,另外Shen 等^［6］报道有一种分子量为150 kD 的非糖基化形式和一种分子量200 kD 的中间形式。而只有成熟糖基化形式的KDR 才能实现胞内信号转导^［7］ 。小鼠VEGFR - 2 又叫胎肝激酶1 受体(fetal liver kinase - 1 , Flk-1),由1 367个氨基酸组成,与KDR 有83％的同源性,Millauer 等^［8］和Arbiser 等^［9］分别报道有180 kD ,200 kD ,220 kD 等几种分子量形式,出现该差异的原因可能也是糖基化形式的不同所造成。VEGFR-2 是一酪氨酸激酶跨膜蛋白,分为胞外段、跨段和胞内激酶活性区。其胞外段有7 个免疫球蛋白样的结构区域( Ig -like domain) ,这7 个区分别有着不同的功能。单独的第2 - 3 区就可以同VEGF 紧密地结合^［9］。Shinkai 等^［10］构建了去除KDR胞外段各个区的突变物,并分别同IgG Fc 段融合,用BIAcore 生物传感器方法分析了它们与VEGF₁₆₅的亲和性。结果显示,去除了VEGFR - 2 胞外段的第3 区会使VEGFR - 2完全丧失与VEGF₁₆₅结合的能力;去除第2 区或第4 区会影响与配体的结合率;去除第5和6 区能影响受体分子与VEGF₁₆₅的分离,而不是结合;而第1 个区有调节受体与配体结合的功能。受体二聚化的部位可能位于第4 区中,而第4-7 区内还含有抑制受体二聚化的结构。当受体和VEGF₁₆₅结合后,构象发生改变,使这种抑制作用解除,受体二聚化,进而引起胞内信号传递^［11］。胞内段含有激活胞内信号传递的重要激酶结构,Dayanir 等^［12］在研究Flk - 1 的信号转导时发现第799 和1173位酪氨酸的分别突变可部分抑制配体对猪主动脉内皮细胞的生长刺激作用,若同时突变这2个位置的酪氨酸,可完全取消配体对内皮细胞的生长刺激作用。Zeng等^［5］研究发现,KDR 第951 位和第1059位酪氨酸的活化分别是VEGF 介导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 迁徙和增殖所必需的。

2 VEGFR-2表达的调节

       虽然VEGF 及其受体在新生血管生成方面的作用得到了广泛的认同,但到目前为止,VEGFR - 2 在血管内皮细胞上的表达调节机制仍不很清楚。根据一些研究资料,我们大致可以归纳如下:

VEGF 是VEGFR-2 表达最重要和直接的调节因子,这种调节作用发生在转录水平上,而且是通过VEGFR -2 自身的信号转导途径起作用的。因为将VEGFR-2上与VEGF 结合的区域突变,或者抑制酪氨酸激酶、Src酪氨酸激酶、蛋白激酶C 和MAPK激酶活性都将阻断VEGF 对VEGFR -2 表达的上调作用^［6］。因此,这实际上是肿瘤新生血管生成的一种正反馈机制:肿瘤细胞在缺氧和其他一些因素作用下分泌VEGF ,它除了同周围正常组织血管内皮细胞上VEGFR - 2 结合产生生物学活性外,又上调VEGFR-2 在血管内皮细胞上的表达,加速了新生血管的形成,有利于肿瘤在缺氧等情况下形成血管以满足其生长的营养需要。

　      低氧是VEGF 最主要的“诱导剂”,低氧对VEGFR-1上调作用的一些研究结果是一致的。但有关低氧直接对VEGFR-2的调节作用还有争论,有报道表达上调、下调或没有明显的调节作用。出现结果不一致的原因还不清楚,但有一点是明确的,低氧可通过上调VEGF的表达而间接的增加VEGFR-2的表达^［13］。

    干细胞白血病( stem cell leukemia, SCL) ,GATA和Ets 转录因子家族成员是重要的造血生成调节剂,它们同时又表达在内皮细胞,参与了胚胎的血管发生和肿瘤新生血管生成。Elvert等^［14］报道Ets-1 的表达和Flk-1 的表达在血管发生和肿瘤新生血管生成过程中具有高度相关性。Kappel 等^［15］在1999年报道了Flk-1 的顺式作用调节元件,随后,他们发现SCL/ TAL - 1 ,GATA 和Ets的结合点正好位于Flk-1的增强子中。进一步的研究证明,低氧诱导因子2α能够和    Ets-1 协同激活Flk-1 基因的转录^［14］。他们的结果首次提供了Flk-1 基因表达的上游调节因子,使Flk-1 的表达机制研究有了突破性的进展。

3 　VEGFR-2介导的信号转导

   　   VEGFR-2 介导的信号转导和其他受体酪氨酸激酶一样,需要经过与配体结合,受体二聚化,酪氨酸激酶激活,受体自磷酸化,调节子在磷酸化位点的结合和激活等过程^［16］

3.1　VEGF 与VEGFR - 2 的相互作用　

只有成熟的VEGF 二聚体与VEGFR - 2 结合后才能引起进一步的信号转导。丙氨酸扫描诱变(alanine-scanning mutagenesis) 显示Arg82 、Lys84 和His86 是VEGF 结合到VEGFR-2 的关键位点,这些氨基酸所在的区域位于VEGF 单体结构的一端,2个这样的单体通过二硫键以头尾相连的方式连接在一起形成二聚体,二聚体的两端就形成了和受体结合的区域^［17］。而VEGF 单体的另一端含有和VEGFR-1 结合的重要位点Asp63 、Glu64和Glu67 ,将这些位点突变后不影响VEGF与VEGFR - 2 的结合^［17］。这样的结构说明VEGF 二聚体能够结合并连接2个VEGFR 以形成同源或异源二聚体。

3.2 　受体二聚体的形成　

VEGF 二聚体的两端分别和一个VEGFR-2 单体结合,这样就促使了VEGFR-2 二聚化的形成。这种二聚化的受体比单体同VEGF 的结合要稳固100倍^［18］。受体形成二聚体的位点可能是在VEGFR - 2 胞外段的第4 区中,在没有和VEGF 结合前,位点可能被第4 - 7 区中的抑制结构所“封闭”,当与VEGF 结合后,由于构象的改变,抑制作用解除,2 个受体结合成二聚体^［11］。

3.3           胞内信号转导

　    VEGFR-2 在二聚化以后,其胞内段的酪氨酸位点发生了自磷酸化,磷酸化的酪氨酸残基可能有控制受体激酶活性和为胞浆内的信号传递分子提供锚点的作用。这些传递分子本身或者是酶,或者是调节子,这样就把VEGFR 和信号转导途径联系起来。

关于VEGFR -2的胞内信号转导途径还有很多争论。不同的研究者在多种内皮细胞中都观察到VEGF 同VEGFR-2 结合后激活了MAPK信号转导途径的现象。虽然一些研究者观察到经VEGF 刺激的内皮细胞出现了Ras -GTP 酶蛋白的磷酸化现象,但Shibuya等坚持认为,VEGFR - 2 与其他受体酪氨酸激酶(如EGFR)不同,它的信号转导似乎不是通过Ras 激活的MAPK途径,而是通过PLC -γ-PKC 激活的MAPK途径^［7，16］。他们还根据自己的实验结果提出了其他的几个支持的证据: ①用VEGF 刺激血管内皮细胞后几乎检测不到Ras-GTP 的形成; ②用重组有显性失活突变体( dominant negative mutant) 的Ras 转染的血管内皮细胞不能阻断VEGF 介导的MAPK 活性和DNA 合成,而它能强有力的抑制PDGF 刺激后Ras介导的MAPK活性; ③KDR 介导的信号转导途径没有激活src 同源域胶原蛋白(Shc)-生长因子受体结合蛋白2 (Grb2)-鸟苷酸交换因子(Sos) 复合物(即Shc-Grb2 -Sos 复合物) ,而此复合物对激活Ras 是十分重要的^［16］。而且,在VEGFR-2 转染的成纤维细胞,VEGF 对MAPK途径的激活被明显延迟,有丝分裂反应也比内皮细胞明显减弱,这种现象提示可能存在细胞类型特异性的信号转导机制^［7］。另外,一氧化氮(nitric oxide, NO) 似乎参与了VEGF介导的MAPK信号转导途径。在毛细血管后微静脉的内皮细胞,如果抑制了NO合酶,也将阻断VEGF介导的MAPK途径^［19］。Hood 等^［20］报道VEGF在刺激HUVECs 增生的同时,激活了Raf-1激酶活性,而这些作用都依赖于NO 和它的下游效应子cGMP 依赖蛋白激酶(cGMP-dependent proteinkinase, PKG)。Flt-1对VEGF介导的新生血管生成的调节作用也可能是通过NO 调节的^［16］。VEGF 还可以通过激活PI3 -K/Akt 途径抑制HUVECs 的凋亡^［4］,而Akt有直接激活NO 合酶的作用^［19］。

　      关于PI3K在VEGF 介导的血管内皮细胞增殖过程中的作用,也有争议。Thakker 等^［21］分析了VEGF刺激的HUVECs 内PI3K和MAPK激活的情况,认为PI3K的激活是VEGF 刺激HUVECs 增殖所必需的,而PI3K又可调节MAPK活性和c -Fos SRE 的转录,进而使HUVECs 增殖。Dayanir 等^［12］构建了人CSF -1R/ c -fms 胞外段与Flk-1 跨膜段和胞内段的融合受体来研究Flk-1 的信号转导,发现VEGFR - 2介导的细胞生长是因为PI3K激活进而激活PI3K/ S6 激酶途径,而不是Ras/MAPK途径。Zeng 等^［22］在研究Flt-1 与Flk-1的相互作用时却发现,激活Flt-1后可抑制Flk - 1 对HUVECs 的增殖作用,如果抑制了PI3K可逆转Flt-1对Flk-1 的抑制作用,因此认为PI3K对Flk -1促HUVECs 增殖功能有抑制作用。细胞内信号转导本身是一个十分复杂的问题,而且在不同类型的细胞,信号转导机制可能有差异,再加上研究者采用了不同的研究手段,这些都可能是造成研究结果不一致的原因。

4 　VEGFR- 2 的生理功能

　        3 种VEGFRs 在功能上有所不同。VEGF 对内皮细胞的主要生理功能几乎都是通过激活VEGFR - 2来实现的,包括刺激内皮细胞增殖,增加血管通透性,对内皮细胞的趋化作用等。前不久,在增加微血管通透性是由哪一个受体介导这个问题上发生过争议,Stacker 等^［23］用不能激活VEGFR-2 的VEGF 突变物同样引起了微血管的通透性增加,认为微血管的通透性不是由VEGFR-2介导的。Gille 等^［3］根据他们自己的研究结果反驳了这一说法,认为单独激活VEGFR-2 即可引起微血管通透性的增加,他解释出现不同结果的原因可能是Stacker的VEGF 突变物仍保留有部分结合VEGFR -2的能力，并且,在研究VEGF_orf (只能同VEGFR-2 结合) 的功能时也发现,单独使用 VEGF_orf 即可引起微血管通透性增加,因此证明VEGFR-2 是介导血管通透性增加的主要受体^［24］。没有争议的是,VEGF 是通过激活VEGFR-2来刺激内皮细胞增殖的,突变VEGF 分子中与VEGFR-2 结合的位点,则使VEGF 丧失了对内皮细胞的增生作用,而突变VEGF 分子中与VEGFR-1 结合的位点不影响VEGF 对内皮细胞的刺激增殖作用^［17］。另外,VEGFR-2在胚胎发育中也起了十分重要的作用,VEGFR-2基因缺陷的小鼠在其胚胎发育第8.5-9.5 天死亡, 有内皮细胞的发育和生成，但不能形成有效的血管腔^{［37，38］} ，主要原因是血管系统和造血系统的发育障碍VEGFR-1 基因缺陷的小鼠则显示血管发育的无序紊乱,显示VEGFR-1在胚胎血管发育中的调节作用^［16］。VEGFR-1在新生血管生成过程中的作用也主要是调节VEGFR-2 的功能^{［22，25］}。VEGFR-3在胚胎期表达于血管和淋巴管内皮细胞,参与了心血管系统的发育;在成人主要分布于淋巴管内皮细胞,在慢性炎性伤口的淋巴血管生成过程中起了一定的作用^［26］。以上的研究表明,VEGFR-2是细胞膜上具有重要功能的受体,介导了VEGF 的多项功能,并对胚胎期血管系统和造血系统的发育至关重要。

5　VEGFR 与肿瘤诊治相关前景　

由于VEGF/ VEGFR -2 在新生血管生成中的重要性,使靶向VEGFR-2 的治疗成为了治疗各种相关疾病的重要策略。可以考虑从VEGF/ VEGFR -2信号途径的各个环节采用不同的措施进行干扰。如,应用VEGF 的异二聚体干扰受体的二聚化^［27］;应用针对Flk-1 的反义寡核苷酸干扰Flk-1 的表达^［28］;采用可溶性的受体竞争抑制VEGF 同天然受体的结合^［29］; 或者用小分子蛋白激酶抑制剂阻断VEGFR-2 的信号转导^［30］,等。这些干扰措施已经在抗肿瘤新生血管生成治疗中取得了较好的效果。随着对VEGFR -2 结构和信号转导机制研究的深入,相关病理生理现象机制将会得到更进一步的阐明,这也将更有利于指导相关疾病的治疗。

          大量研究证明,VEGFR 在正常人体组织中呈低水平表达,而在绝大多数肿瘤中呈现高表达,且VEGF 受体不仅表达于血管内皮细胞,还表达于肿瘤细胞,故认为除旁分泌外,还存在自分泌途径。它不仅促进血管内皮细胞分裂、增殖,且诱导肿瘤血管增生,并促使其肿瘤细胞生长转移。在肿瘤组织内VEGFR 的表达明显高于正常内皮细胞,血管的发生对于肿瘤的生长和转移起着关键的作用。因此,将VEGFR 作为靶点,可为治疗和诊断肿瘤提供新的理论依据。国内众多作者报道,VEGF 受体在肿瘤组织中的表达上调,并伴随肿瘤分级的上升而表达增强。同时,在肿瘤组织中VEGF 的表达呈正相关。证明VEGF 和一些其他生长因子相似,可以在不同状态下调节本身的受体表达,以达到促进肿瘤细胞增生、临床恶性程度上升及转移的功能。

Harada 等^［31］报道,血管内皮生长因子受体,在胃癌、结肠、直肠、卵巢、乳腺癌^［32］等多数肿瘤组织中的表达明显增高,并与其生物学行为相关。但是,在Fine 等^［33］的研究中,子宫内膜癌的转移、复发及预后仅与临床分期和病理分级有关,而与VEGFKDR、FLT -1的表达无显著关联,可能与子宫内膜VEGF 及受体表达与体内雌孕激素调控有关。

Cha 等^［34］在绒毛膜癌BeWo 细胞上发现了KDR 的强表达,而且绒毛膜癌BeWo 细胞在被VEGF刺激呈明显增生,这种增生可以被内皮细胞源性一氧化氮抑制。该抑制有可能被NO 合成酶抑制剂解除,酪氨酸酶抑制剂对这种增生也有抑制作用。Kamiyama 等^［35］报道了反义KDR/ FLT -1( KDR/FLT-1 - ASO) 对人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型腹腔转移的作用。深入研究VEGFR 在肿瘤血管生成中的作用,证明阻断受体作用机制有望成为抑制血管生成及肿瘤生长的有效治疗措施。通过VEGF 相关抗体、VEGF 反义寡聚核甘酸及VEGF 受体抑制剂等来阻断VEGF 受体的功能,可达到抑制肿瘤血管进一步形成的目的。鉴于KDR 在肿瘤组织中的血管内皮细胞和肿瘤细胞表面的高度表达,及其所具备的特异性,将使其成为一个肿瘤靶向治疗和诊断的新位点。VEGF及其受体在恶性肿瘤中的协同表达,旁(自)分泌作用机制的确立均为肿瘤治疗提供了新思路。近年来也有采用各种遏制VEGF 及其受体的合成分泌,并阻断两者间相互作用的研究,既抑制VEGFR 活性,阻断其间信号转导,又达到阻止肿瘤血管新生的作用,进而抑制肿瘤生长及转移。近年来,采用各种方法研究VEGF 抑制剂,很多已进入临床实验。目前, IM clone 公司开发研制了抗KDR 抗体C1CC11^［36］已进入临床研究阶段,此举将大大推进VEGF 受体的研究进程,在肿瘤治疗方面迈出新的可喜一步。

VEGF 受体的发现使人们对肿瘤血管的生成机理有了更深刻地的认识,下一步如何将VEGF 受体做成诊断试剂,并开拓临床治疗新领域,为找到新的有效药物奠定基础。新的研究理念将在开发和研制VEGF 受体抑制剂、VEGFR 拮抗剂、血管形成抑制剂等方面发挥一定的作用。随着现代分子生物学技术的不断发展,对于VEGF 受体的功能结构及其应用的研究将不断深入,有望尽快进入临床治疗。