原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎重叠综合征的临床与病理分析

湖北省荆州市第二人民医院

科学技术报告

 

 

 

            项目名称：原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎荆州市第二人民医院肝病科朱刚剑

                      重叠综合征的临床与病理分析

            完成单位：荆州市第二人民医院

                      第三军医大学西南医院

            课题负责人：朱刚剑

 

 

            工作完成时间：二００四年一月

            报告时间：二００六年二月

 

 

 

资料目录

 

一、研究报告正文

1．任务来源

2．研究目的与意义

3．国内外研究现状

4．主要研究内容

5．本课题特色与创新之处

6．经济效益与社会效益分析及应用前景

7．存在的主要问题

 

二、湖北省医学情报研究所?科技成果鉴定查新报告书（编号2005207）

 

三、发表的研究论文

朱刚剑，陈嵩，毛青，王宇明。原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎重叠综合症的临床与病理分析。中华肝脏病杂志，2005，13(1)：6-8

 

四、应用证明

1荆州市中心医院应用证明

2荆州市第一人民医院应用证明

3荆州市第三人民医院应用证明

4荆州市中医院应用证明

 

  

 

 

研究报告正文

一、任务来源

    自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)发病率世界各地不同，在北美和西欧的白种人PBC/AIH重叠综合征发病占PBC的9～12％。我国PBC/AIH重叠综合征的发病状况尚不清楚。2000年和2002年美国肝病学会(AASLD)发表了PBC、AIH诊断指南，已引起国内对PBC和AIH的重视，我国对PBC、AIH报道也逐渐增多，但是涉及PBC/AIH重叠综合征患者的仅有零星报道，对PBC/AIH重叠综合征的全面了解尚有差距，可能是由于对该病的认识和诊断均欠完整。有必要对中国人自身免疫性肝病患者及早明确是否存在PBC/AIH重叠综合征，并摸索适合我国PBC/AIH患者的诊断、治疗方案，以提高临床医师对该病的认识和诊断。

    在荆州市科技局指导下，荆州市第二人民医院肝病中心联合第三军医大学西南医院拟定了“原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎重叠综合症的临床与病理分析”的科研课题。

二、研究的目的与意义

1、目的：本项目主要研究PBC/AIH重叠综合征的临床与病理分析，拟通过肝组织病理学检查和直接免疫荧光检查探讨PBC/AIH重叠综合征的发病机制，并采用熊去氧胆酸（UDCA）和糖皮质激素对患者进行联合治疗，摸索PBC/AIH重叠综合征患者的治疗方案。

2、意义：探讨中国人PBC/AIH重叠综合征发病机制和临床、病理学特征，制定合理治疗方案，以提高临床医生对该病的认识和诊断治疗水平，减少误诊误治。

三、国内外研究现状

    自身免疫性肝病为自身免疫反应超越生理限度或持续时间过久引起肝组织损伤，肝功能异常及出现相应临床症状的一组疾病。这组疾病通常包括：自身免疫性肝炎(AIH)，原发性胆汁性肝硬化(PBC)及原发性硬化性胆管炎(PSC)。我国成人以AIH和PBC常见。目前,对自身免疫性肝病认识还不充分，许多问题如相关病因、发病机制至今尚不清楚，临床上对其诊断与治疗也存在较大分歧。而早期诊断及治疗对这些疾病发展及预后至关重要。

     PBC和AIH是两种独立的肝脏疾病, 两者的临床特点、疾病进程及治疗方法明显不同。AIH通常反复活动，有时迅速发展，如未经免疫抑制剂治疗，可在较短时间内发展为肝硬化或肝衰竭。AIH多发于女性, 有10～30岁及40岁以上２个发病年龄高峰。2002年美国肝病学会(AASLD)发表的诊疗指南中提出了较为详细的诊断依据，其要点如下：血清转氨酶(AST、ALT)明显升高、球蛋白、γ球蛋白或IgG≥1.5倍正常上限；自身抗体阳性，如抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗-LKM1≥1:180(成人)或≥1:40(儿童)，但抗线粒体抗体(AMA)阴性；肝脏病理学改变：界面性肝炎(汇管区和肝实质界面的炎症)，汇管区周围淋巴细胞或浆细胞炎症，肝细胞形成玫瑰花结和/或碎屑样坏死，且无胆管损坏、肉芽肿或提示其它疾病的病变。也有部分病人抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、抗可溶性肝／胰抗原抗体(抗-SLA/LP)、抗肝胞质抗原-1抗体(抗-LC-1)或抗-泛唾液酸糖蛋白受体抗体(抗-ASGPR)阳性。在白种人群中,大部分AIH患者具有特殊的免疫遗传背景（HLA-B8、DR3或DR4）。与HLA-DR3有关的AIH患者一般年龄较轻，病情进展快，常在免疫抑制剂治疗停药后复发，因而需作肝移植的可能性较大；相反，HLA-DR4阳性的患者常在40岁以后发病，疾病活动度中等，对免疫抑制剂治疗反应良好，较少作为肝移植的候选者。

     PBC是一种慢性破坏性肉芽肿性胆管炎，主要累及肝内中小胆管，最终发展为肝硬化。PBC多见于中老年女性。2000年AASLD发表的PBC诊断指南：碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）等反映胆汁淤积的生化指标升高，B超检查示胆道系统正常，同时血清AMA≥1:40和/或AMA-M2阳性；PBC组织病理学特点为进行性、非化脓性、破坏性胆管炎。其最具诊断意义的改变为小叶间胆管炎、汇管区淋巴细胞聚集甚至形成淋巴滤泡，可有非干酪样肉芽肿形成，最终小叶间胆管消失。有些病例有典型的肝内胆汁淤积的症状和生化改变，虽然血清AMA阴性，但经肝穿刺病理学检查有典型PBC改变者，称为AMA阴性的PBC。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）是唯一对PBC有效的药物，能有效改善肝功能，延长生存期或肝移植前期。因为UDCA并不能去除PBC的病因，因此需要终生治疗或直至肝移植。

     近年来，人们越来越注意到临床上有些患者既有AIH的临床特点，包括ALT显著升高，高丙种球蛋白血症和血清ASMA和/或ANA阳性；还有类似PBC的一些临床特征，如血清AMA阳性和胆汁淤积的生化表现；组织学特征包括: 各种炎症细胞直接浸润胆管和肝细胞，与多形性或肉芽肿性胆管炎相关的汇管区和汇管区周围淋巴浆细胞浸润和/或胆管消失，界面炎或与肝细胞肿胀或嗜酸性坏死性有关的弥散炎细胞浸润。这类疾病被命名为PBC/AIH重叠综合征(overlap syndromes)。部分患者的AIH和PBC特征不是同时出现。有些重叠综合征患者先表现PBC特征，数年后再出现AIH特征；确诊AIH的部分患者可出现PBC特异的AMA；反之, 亦可于AMA消失后出现ANA阳性。另有文献报道，几乎所有AIH/PBC重叠综合征患者表现AIH相关的HLA-DR单倍型。由于AIH/PBC重叠综合征表现明显的肝内胆小管损害，严格地说它应归于PBC诊断，而广泛的肝炎特征可能与宿主遗传易感性有关。

四、主要研究内容

1．资料和方法

1.1  研究对象的选择  研究对象为荆州市第二人民医院及西南医院1993年1月至2003年1月确诊为PBC的住院患者，PBC诊断参照2000年AASLD发表的PBC诊断指南： ALP、GGT等反映胆汁淤积的生化指标升高，B超检查示胆道系统正常，血清AMA≥1:40，和/或肝组织病理学（小叶间胆管炎、汇管区淋巴细胞聚集甚至形成淋巴滤泡，可有非干酪样肉芽肿形成或小叶间胆管消失）符合PBC的改变。同时参照1998年国际AIH小组（IAIHG）修正AIH临床评分标准，对每例患者临床治疗前进行评分，从中筛选具有AIH特征的PBC患者，临床诊断PBC/AIH重叠综合征。

1.2  研究指标

① 患者的年龄、临床症状、肝功能及其他生化检查指标：包括ALT、AST、TBil、DBil、ALP、GGT等。

② 免疫学指标：AMA、ANA、ASMA、抗-LKM1、lgG、IgA、IgM等。

③ 肝组织病理学检查。

④ 肝组织直接免疫荧光检查。

⑤ 伴其他自身免疫性疾病的情况: 干燥综合征，硬皮病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎、Sjögren 综合征及溃疡性结肠炎。

⑥ 药物疗效判断：药物治疗后症状消失、血清胆红素恢复正常、ALT≤正常值的2倍、ALP≤治疗前水平的50%为有效，否则为无效。

1.3 实验方法和步骤

① 间接免疫荧光法检测血清中ANA、SMA、AMA、抗-LKMl: 试剂盒购自欧蒙公司，试剂号FAl300?1005?2(肝脏马赛克2，ANA、SMA、AMA、抗-LKMl)。肝脏马赛克2选择HEP-2细胞和5种组织(猴肝脏和心肌组织大鼠肝、肾和胃组织)的冰冻切片作为抗原，采用生物薄片马赛克技术(biochipmosa)将带有细胞和组织的6种切片组合成一个反应区。4℃保存备用。待捡血清1:100起稀释，与组织细胞孵育30分钟；加入硫氰酸荧光素(FTTC)标记的抗体结合30分钟；洗片、封片后荧光显微镜观察结果。组织或细胞内出现特异性绿色荧光、血清稀释度＞1:100为阳性。粒细胞马赛克1操作过程与上述基本相同，血清稀释度1:10为阳性检测。

② ELISA 方法检测全部血清的病毒性肝炎指标:抗-HAV IgM、HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe 、抗-HBc 、抗-HCV、抗-HEV IgM和IgG等。

③ 肝组织病理学检查：B超引导行肝活检术，活检标本分别用10%福尔马林固定， 石腊包埋，切片做HE染色，光镜检查。

④ 肝组织直接免疫荧光检查：石腊切片按常规脱腊和酶消化处理后，用0.01mol/L  PBS (PH7.2)洗5分钟，冷风吹干，切片上滴加异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗人1gG，放入湿盒中置37℃温箱，孵育30分钟，PBS液中洗3次、蒸馏水洗1次，烘干后滴加缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察。

1.4 统计学处理  采用SPSS 10.0软件包进行统计学处理，计量资料用方差分析，计数资料用卡方检验。

2．结  果

2.1 PBC/AIH重叠综合征的临床表现   9例PBC/AIH重叠综合征中，男1例，女8性，平均年龄（48.1±6.1）岁，乏力8例，，纳差5例，皮肤瘙痒5例，黄疸4例，有1例无明显自觉症状。与单纯PBC患者比较，重叠综合征患者的年龄、性别、临床症状及肝功能失代偿〔腹水和/或〕上消化道出血〕比例的差异均无统计学意义。治疗前总评分PBC/AIH重叠综合征患者为10.2±0.2，单纯PBC患者为4.7±0.7，两者比较差异有统计学意义，t ＝48.71，P＜0.01。

2.2 实验室检查   重叠综合征患者的ALT、AST、γ球蛋白及1gG水平显著高于单纯PBC患者，重叠综合征组ANA和（或）SMA阳性7例（77.8%），单纯PBC组11例（18.6%），c2＝11.16，P＜0.01。重叠综合征患者和单纯PBC患者在GGT、ALP、凝血酶原时间、白蛋白、球蛋白、TBIL、lgM等方面差异无统计学意义，见表1。

表1  重叠综合征患者及单纯PBC患者的实验室检查结果（ ±s）

检查指标 (正常参考值)	重叠综合征 (9例)	单纯PBC (59例)	t值	P 值
ALT(IU/L)(0-42)	204.9±80.2	112.5±71.8	t ＝3.54	P＜0.01
AST(IU/L)(0-42)	191.5±72.2	125.3±61.7	t ＝2.93	P＜0.01
GGT(IU/L)(4-50)	501.6±408.6	533±427.8
ALP(IU/L)(53-114)	450.8±321.2	551.1±358.8
γ球蛋白(%)(12-20)	23.1±3.3	20.7±2.5	t ＝2.57	P＜0.05
lgG(g/L)(7.82-16.8)	21.7±4.1	18.1±3.2	t ＝3.03	P＜0.01
lgM (g/L)(0.63-2.77)	5.2±1.8	4.9±1.7

2.3 伴其他自身免疫性疾病的情况  68例患者PBC患者中22例有相关的自身免疫性疾病，伴发干燥综合征16例，硬皮病、类风湿性关节炎各2例，桥本甲状腺炎、雷诺现象各1例。重叠综合征患者和单纯PBC患者分别有6例和16例合并有干燥综合征等其他自身免疫性疾病，两者之间差异有统计学意义，c2＝3.32，P＜0.05 。

2.4  肝组织学检查   68例PBC具有小叶间胆管炎、汇管区淋巴细胞聚集、淋巴滤泡、肉芽肿形成及细小胆管增生，而汇管区原有的小叶间胆管消失。9例PBC/AIH重叠综合征患者在组织病理学上兼有PBC和AIH的双重特点，界面炎/碎屑坏死达到88.9%，见图1。根据国际自身免疫性肝炎小组修订的AIH临床评分标准，对重叠综合征及单纯PBC病理学特征进行评分比较，结果见表2。

表2   重叠综合征及单纯PBC病理学特征及评分比较（例，％）

	重叠综合征 （9例）	单纯PBC （59例）	统计值	P 值
界面炎/碎屑坏死	8（88.9）	14（23.7）	c2＝12.32	P＜0.01
浆细胞浸润	9（100.0）	51（86.4）
玫瑰花结	2（22.2）	7（11.9）
胆管病变	9（100.0）	55（93.2）
其它病理改变	0	4（6.8）
肝脏组织学评分	0.04±0.30	-1.8±0.20	t ＝17.81	P＜0.01

 

  

图1：慢性重度肝炎，有明显的碎屑样坏死，小叶内炎症，HE×100

  

图2：高倍显微镜下同一个病人的肝活体组织检查标本

         显示汇管区细小胆管增生，炎症细胞浸润。HE×200

2.5  肝组织学检查肝组织免疫荧光检查   9例PBC/AIH重叠综合征患者肝组织均可见到不同程度的特异性黄绿色荧光，6例呈点状、线状沉积，有少量颗粒状荧光团，3例可见大量颗粒状荧光团沉积，底色明亮（图3）

  

 

图3  肝活体组织检查标本可见点状、线状特异性荧光

和大量颗粒状荧光团，底色明亮。荧光×200

2.6 随访及治疗反应  9例PBC/AIH重叠综合征患者中，4例采用熊去氧胆酸治疗，250mg，3次/d，平均疗程（19±13）个月，有效2例，无效2例。5例采用熊去氧胆酸（250mg，3次/d）和强的松龙（50-60mg/d）治疗，以后逐渐减少用量，强的松10mg/d维持治疗，平均疗程（18±14）个月，有效5例。

3、讨 论

    研究采用1998年国际自身免疫性肝炎小组修订的AIH临床评分标准，从68例PBC患者中筛选出9例I型AIH患者，临床诊断PBC/AIH重叠综合征，占13.2%。PBC/AIH重叠综合征和单纯PBC比效，ALT、AST、lgG水平显著高于单纯PBC患者，血清SMA阳性率也高于单纯PBC患者，也更易伴随其它自身免疫性疾病。新的AIH诊断标准和计分系统目前已被广泛应用，它的敏感性为89.8%。然而，PBC/AIH重叠综合征治疗前总评分为10.2±0.2，用国际自身免疫性肝炎小组修订的计分系统区别AIH与PBC/AIH重叠综合征的特异性降低。

    迄今，PBC/AIH重叠综合征的发生机制尚未阐明。从肝组织学看，界面炎/碎屑坏死在PBC/AIH重叠综合征中高达88.9%，但单纯PBC仅23.7%，这在一定程度上可解释重叠综合征患者为何有着较高的转氨酶水平。同时，直接免疫荧光检测均可见到肝组织有大量的lgG沉着，这说明体液免疫参与了肝细胞的免疫损伤，同时也为抗体依赖的细胞毒作用创造了条件。结合光镜下检查可见汇管区淋巴细胞聚集、淋巴滤泡及肉芽肿形成，提示肝细胞的损伤是体液免疫和细胞免疫共同作用结果。Chazouillères等报道12例PBC/AIH重叠综合征患者，11例同时表现出PBC、AIH的双重特征。1例AMA阳性PBC患者在熊去氧胆酸治疗过程中SMA由阴性转为阳性，ALT及gG升高，肝组织学显示界面炎，而加用皮质激素治疗SMA由阳性转为阴性，同时ALT、lgG下降至正常水平，提示PBC/AIH重叠综合征既可能是同时存在的两种疾病，也可能随着病程进展，两种疾病呈连续发展。

    近年来人们主张PBC的治疗应以熊去氧胆酸为主，而AIH的治疗应以糖皮质激素为主，对那些具有PBC/AIH重叠综合征的患者采用何种治疗尚未形成共识，本研究发现PBC/AIH重叠综合征患者对UDCA和糖皮质激素联合治疗疗效较满意，但联合治疗是否适合长期治疗尚有待进一步积累治疗。

五、本课题特色与创新之处

    本研究总结了PBC/AIH重叠综合征患者的临床、病理学特征，并进行了肝组织病理学检查和直接免疫荧光检查，以及治疗方案的探索。

    主要创新点包括：（一）在国内率先开展PBC/AIH重叠综合征的临床和病理研究，（二）通过肝组织病理学检查和直接免疫荧光检查探讨其发病机制，并在国内首次公布其病理照片和肝组织免疫荧光照片。（三）在国内率先采用国际自身免疫性肝炎小组（IAIHG）新修订的描述性诊断标准和计分系统，从PBC患者中筛选出重叠综合征患者，以提高该病的早期诊断。（四）采用熊去氧胆酸(UDCA)和糖皮质激素联合治疗，与单用熊去氧胆酸组对照观察，为其制定合理治疗方案提供可靠的理论及实践依据。

六、经济效益与社会效益分析及应用前景

    我国是慢性肝病的高发区，病毒性肝炎占大多数，但是肝炎病毒感染指标阴性、原因不明的慢性肝病患者并非少见，其中一部分可能就是自身免疫性肝病。因过去技术条件和理论所限,不少临床医生对本类疾病重视不够。以致临床有些患者已出现明显黄疸或发生肝硬化失代偿仍未得到正确诊断。上海市静安区中心医院姚光弼对确诊的40 例原发性胆汁性肝硬化( PBC) 病人作较详细的前瞻性观察，发现从发病到确诊平均为4.5年,最长可达20 年之久。在这期间由于诊断不明,多数误用抗病毒、保肝、利胆等药物,一般花费至少为人民币2～4 万,最多1例辗转全国各大医院治疗,药费高达20 多万元。

    本项目主要研讨原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎重叠综合征的临床与病理分析，并通过肝组织病理学检查和直接免疫荧光检查对其发病机制作一定探讨，同时在治疗上进行对照观察和随访，摸索适合我国PBC/AIH患者的治疗方案。为临床医生提高对该病的认识和诊断水平创造了很好的条件，有良好的社会、经济效益和广阔的应用前景。

七、存在的主要问题：

①非典型AIH的诊断主要采用国际AIH小组1999年修订的AIH评分标准。由于AIH与宿主遗传背景有密切关系，而欧美人群(白种)与中国人群(黄种)遗传背景存在明显差异。因此，修订的AIH评分标准用于中国人AIH的诊断仍需进一步完善。

②由于人类遗传背景的复杂性，PBC/AIH重叠综合征与AIH相关的HLA-DRB1等位基因有密切关系，并不能充分说明PBC/AIH重叠综合征的遗传易感性。进一步研究PBC/AIH重叠综合征的遗传易感背景，有助于阐明该病的发生原因。

③有关PBC/AIH重叠综合征的发生原因仍不清楚。PBC/AIH重叠综合征是PBC在其病程中伴有AIH的某些特征, 还是在同一时段或病程中具备两种疾病的临床表现、血清学及组织学特征, 尚有待阐明。