肿瘤的生物治疗4---基因治疗

 （五）、肿瘤基因治疗

 “基因治疗”这一概念，即通过对人体遗传物质进行修正、补充或改造来达到治疗疾病的目的，或曰“以基因作为靶点的治疗”。也有人将其定义为“将遗传物质导入人体组织或细胞所进行的疾病的治疗”。这两种定义有所区别：前者强调以基因作为手段。但事实上，要针对遗传物质来治疗疾病，往往也必须利用遗传物质。南京军区总医院肿瘤内科于正洪

肿瘤的基因治疗是将核苷酸转移到靶细胞中以扰乱或纠正某些病理生理过程或其他物质和手段可以通过纠正靶细胞中的基因或基因产物的异常而达到同样的目的。

目前，基因治疗可以分为体外基因治疗（离体基因治疗）和广义的体内基因治疗（包括原位基因治疗和狭义的体内基因治疗）。体外基因治疗是目的基因在离体(ex vivo)情况下，在体外导入（转移或转导到）靶细胞??自体或异体来源的肿瘤细胞、免疫细胞或其他细胞中，然后再将这些修饰过的靶细胞转入体内。原位基因治疗是将目的基因载体直接导入体内的肿瘤组织，进行局部性基因治疗，这是目前应用最多的一种方法；狭义的体内基因治疗是将目的基因载体注射到血流系统进行全身性基因治疗。要完成这一任务，牵涉到两个相互独立而又有关联的因素，即治疗性的核苷酸或目的基因及其运载系统。基因的作用机制、大小、表达的稳定性、预期的效果等均是选择的重要因素；而第二个因素则决定能否把一个治疗性的基因有效地运载到靶细胞并进行表达。

（1）目的基因   根据作用机制可将其分为两大类

调节机体免疫系统  由于在肿瘤的发生过程中存在着机体免疫对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能既源于肿瘤细胞本身的免疫原性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递呈细胞（antigen presenting cells APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7），或者机体免疫因子分泌不足，或肿瘤细胞诱导机体的免疫抑制。因此，可以将某些细胞因子（如Il-2，Il-4，Il-1，Il-6，Il-7，Il-12，INF-α，G-CSF，GM-CSF等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。另一方面，由于肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和（或）共刺激信号表达不足，也可以将一些与免疫识别有关的基因（HLA、 B7等）转染至体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者；或者将表达HLA-B7的病毒表达载体或质粒DNA与脂质复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。不过，由于免疫反应是由一个非常复杂的分子网络来调节，转染一二个基因可能难以激活机体对肿瘤的免疫反应。值得一提的是，近年随着DNA疫苗的发展和一些肿瘤特异抗原的发现，肿瘤疫苗又引起许多研究者的兴趣。在肿瘤细胞中突变率很高的一些癌基因和抑癌基因如Ras、p53、Rb等，它们的蛋白质结构的变异，可形成肿瘤细胞特有的抗原决定簇，而可以把这些突变的基因制成DNA疫苗。

肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因： ①抑癌基因治疗  相比于正常细胞，肿瘤细胞的生长和增殖能力明显增强；而这种生长表型又是基于基因水平的抑癌基因的失活和（或）癌基因的过度激活。对于癌基因的过度活化，可以用反义核苷酸或核酶来进行阻断。抑癌基因则具有负性调控细胞生长和增殖的作用，当因突变或缺失而丧失功能时可促进细胞的生长和增殖。因此，可以将具有正常功能的野生型抑癌基因通过各种途径转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞的正常的生长表型，或者诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。在目前已经发现的抑癌基因中，P53是研究和应用得最多的一个。②EIB缺陷的腺病毒基因治疗  P53是肿瘤细胞中突变最高的一个抑癌基因，利用肿瘤细胞和正常细胞中P53有无突变的差别，以EIB缺陷的腺病毒转染肿瘤组织，由于病毒的大量繁殖导致肿瘤细胞裂解死亡；而在有P53功能的正常细胞中，病毒的繁殖力低下，毒性很小，从而达到选择性杀伤肿瘤细胞的目的。对于EIB缺陷的腺病毒的应用，要十分慎重，严格掌握好给要剂量，因为这种EIB缺陷的腺病毒还具有自主复制能力，在肿瘤细胞中大量复制的病毒在细胞破裂释放出来之后，除了可以再攻击其他肿瘤细胞之外，还可以经血液循环扩散至全身，产生毒性反应。③ 抗血管生成基因治疗  将基因治疗的载体给药技术与血管生成抑制剂结合起来，利用重组逆转录病毒或腺病毒载体表达Angiostatin 或 Endostatin cDNA。结果证明，在体外可以抑制血管内皮细胞的生成。④ “自杀”基因治疗   除了利用肿瘤细胞与正常细胞的天然差别进行基因治疗外，还可以人为地改变肿瘤细胞的状态，如将“自杀”基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSK-TK)转染至肿瘤组织，使肿瘤细胞成为有别于正常细胞、表达HSK-TK的细胞，能将前体药物 Acyclovir或Gancyclovir转化为对分裂细胞具有杀伤作用的代谢产物，从而特异性地杀伤肿瘤细胞。⑤“修饰”基因治疗   在肿瘤治疗中，还有一种方法是利用基因技术最正常细胞进行修饰，如将化疗药物的多药耐药基因转染至肿瘤患者的造血干细胞，使其具有比肿瘤细胞更强的化疗药物耐受力，可以提高临床化疗剂量和时间，而减轻化疗最主要的副作用??对骨髓细胞的损害。此外，某些造血因子的基因，如GM-CSF导入造血干细胞也可以达到类似的目的。. 

（2）载体运载系统  也叫载体(Vector)

载体是一个微基因盒(Minigene cassette)。由一段能启动靶基因或转基因转录的核苷酸或叫启动子的成份和一个聚腺苷酸化信号(Polyadenylation signal)组成。后者能稳定转录了的mRNA。这个微基因盒通常位于一大段核苷酸的主链骨架里。这一骨架的序列可以简单到象在噬菌体里的一样，因此可使载体在体外随细菌而增殖。也可复杂到象大DNA病毒一样。此外，这个微基因盒通常由其他一些大分子所包绕，如蛋白和碳水化合物等。它们在转基因的稳定性、靶向性和表达上执行某些特异性功能。

 用于基因治疗的载体有两大类：一类是病毒载体，较常用的有反转录病毒、腺病毒、腺相关便毒与单纯疱疹病毒等；第二类是非病毒介导的载体，其中较常用的为脂质体载体，方法较简便，但其转移效率低于病毒载体，如其中加入转铁蛋白，则可提高转移效率。目前在载体系统研究中的一个热门课题是其靶向性问题，即如何使导入的外源性基因高度聚集于肿瘤组织中，并在其中高效表达。基因转移的靶向性分两个层次：第一是靶向转染，如将基因直接注入瘤内，或注入肿瘤的供血动脉，也可利用带有阳离子的脂质体使其能和某些肿瘤组织特异性地结合。第二是靶向表达，是指在靶基因前加上适当的转录调控序列，使其只在靶细胞中特异性表达。由于肝癌细胞内甲胎蛋白高表达，而大肠癌、肺癌和胃癌中则癌胚抗原高表达。如将甲胎蛋白或癌胚抗原加在靶基因前面作为转录调控序列，再导入相应的肿瘤组织中，则可由于细胞核内甲胎蛋白或癌胚抗体蛋白的反式调控作用与转录调控序列的顺式作用相结合，而使靶基因在肿瘤细胞中特异地高效表达。

基因治疗经过多年的理论探索和研究实践，可以说已经告别了婴儿时期，正逐步走向成熟。但要想将其作为外科手术、化疗和放疗之后肿瘤治疗的一种常规疗法，则还有非常大的距离，还有许多的理论和技术问题有待解决。主要的问题仍然是组织和细胞选择性、高效率的载体、更富杀伤力的目的基因、如何与其它肿瘤治疗手段有机地结合起来，以及如何进行准确的疗效评价等。 

到目前为止，已鉴定的认为可能有治疗价值的基因数量迅速增加。美国FDA已批准的治疗肿瘤的临床试验项目已有100多项。其中以P53在头颈部肿瘤和非小细胞肺癌做的工作最多，已看到有PR、CR和生存期延长的病例。目前这一观察还在继续进行中。然而，能否真正将治疗性基因成功地运用到人体的特定部位中还取决于一个有效的高度选择性的转运系统和高效的基因表达。1999年9月17日宾西法尼亚大学人类基因治疗研究所发生的一例死于基因治疗本身的意外事故正是说明了这个问题。虽然输注了38万亿个腺病毒颗粒企图在肝脏得到足够的鸟氨酸甲酰氨转移酶(OTC)基因的表达以纠正遗传酶缺陷病；但仅有1%转基因达到靶细胞且未看到明显的基因表达。而过量的病毒颗粒分布到全身各器官激发了内在的免疫性和全身炎性反应，导致了病人的死亡。因此，目前在基因治疗的基础科学研究上更多的精力还是强调发展更好的载体。

另一方面，基因治疗的进展也显示出一些可喜的苗头。在法国巴黎的第十届国际抗癌会议上Momparler等曾经报告了6例Ⅳ期非小细胞肺癌的病人在验证新药Decitabine的I期临床试验中，有3例活过了16个月。该药的作用机理是重新激活肿瘤抑制性基因来防止正常细胞转化成癌细胞和诱导肿瘤细胞的再分化，使其转回正常细胞。由于结果意外地好，未等I期做完就抢先进行了报道。国际权威学者说：“基因治疗是一个初生婴儿，但人们对它期望过高，甚至有些苛求，我们不可能创造出一个５岁就能写出音乐作品的神童莫扎特，但是可能我们已经创造出了一个贝多芬，他３０岁才写出“第一交响乐”，他的“英雄交响乐”写于３５岁，这部“英雄交响乐”终于引起了音乐史上的一场革命”。这段话提示：肿瘤基因治疗道路尚长，但前景乐观。相信在完成人体基因组（Ｈuman Ｇenone Ｇrop）工程后，在２１世纪完全能将所有基因分离，搞清其结构与功能，至时人类对人体乃至生命本质的认识将有一个质的飞跃，将彻底改变目前临床医学。无疑癌症基因治疗是２１世纪的肿瘤研究重点，在基础研究与临床应用将有突破性进展。