心肌康干预小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎慢性期病毒复制及心肌纤维化的影响

[摘要] 目的：探讨心肌康治疗小鼠柯萨奇B₃（CVB₃）病毒性心肌炎（VMC）慢性期的疗效。方法：动物分为 VMC组，心肌康组，氯沙坦组，正常组，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，定量观察心肌康在体内对RNA复制的影响；HE染色及苦味酸天狼猩红胶原特异染色偏光显微镜观察心脏间质 I、Ⅲ型胶原的表达，并半定量分析。结果：心肌康组CVB₃-RNA水平明显低于正常对照组，（P＜0.01，且该组I、Ⅲ型胶原表达水平明显降低，疗效与氯沙坦组相当。结论：心肌康具有明显抑制CVB₃-RNA复制和抗心肌纤维化的作用，可能为一种良好的治疗慢性病毒性心肌炎的药物。河南省中医院心血管内科王振涛

[关键词]：病毒性心肌炎慢性期  心肌康    病毒复制  I、Ⅲ型胶原

   

   心肌康系王振涛教授多年治疗慢性病毒性心肌炎的经验方，临床疗效显著，为探讨其作用机理，我们采用腹腔接种柯萨奇B₃（CVB₃）诱导慢性病毒性心肌炎模型，着重探讨心肌   

康对病毒性心肌炎慢性期柯萨奇B₃病毒的复制及对心脏胶原表达的影响。

一材料及方法

1．实验材料

1．1 实验动物  清洁级Balb/c小鼠340只，3周龄，纯种，雄性，体重9～12g，上海医科大学动物中心提供，动物合格证号：01116。

1．2 病毒株   CVB₃(Nancy株)由上海中山医院卫生部病毒性心脏病重点试验室惠赠。实验用病毒量为100 TCID50。

1．3 实验药物  心肌康  由黄芪、西洋参、麦冬、五味子、丹参、苦参等组成，水煎浓缩至每毫升相当于生药2g，分装成100ml/瓶。由河南省中医院制剂室研制。。氯沙坦钾片（科索亚） [国药准字X20000371]，50mg/片，由杭州默沙东制药有限公司生产，灌胃前用无菌双蒸水配制成浓度为2mg/ml的混悬药液。

1．4 实验所需试剂 总RNA提取试剂为上海华舜生物有限公司长品， RT-PCR 试剂为美国 promega 公司产品，CVB3上游为C1 5´-CCC CGG ACT GAG TAT CAA TA-3´下游为C2 5´-GCA GTT AGG ATT AGG CGC AT-3´扩增产物大小为300bp，β-action 上游M1 5´-GTC ACC CAC ACT GTG CCC ATC T-3´下游M2 5´-ACA GAG TAC GCG CTC AGG AG-3´扩增产物大小为542bp，引物参照文献^[1]由上海生工生物技术公司合成。天狼猩红英国 Mobay Chemical公司生产，苦味酸、苏木精等均由上海华舜生物有限公司生产。

2方法

2 1 动物模型的制作及分组

取3周龄、纯种、雄性、正常Balb/C小鼠300只由上海医科大学动物实验动物中心提供。首次腹腔接种CVB₃内含100TCID50病毒稀释液0.1ml/只后常规饲养，后每隔15天腹腔接种同种浓度CVB₃病毒液0.1ml/只，共3次，50天以上成活小鼠为病毒性心肌炎慢性期模型，共115只，按照随机数字表法分为3组：A组为VMC组（38只）、B组为心肌康组（38只）、C组氯沙坦组（39只）。另设20只腹腔接种不含病毒的Eagle’s液小鼠为正常对照组（D组），腹腔接种Eagle’s液，接种方法及时间同上。

2 2 给药方法及用量

心肌康、氯沙坦用量均为成人剂量的15倍,一日一次灌胃。因心肌康浓度太高，灌胃前用无菌双蒸水稀释为1g/ml。从造模第50天开始灌药，共30天。A组（VMC组）: 管饲与心肌康同等容积的生理盐水，B组（心肌康组）:管饲心肌康水煎剂15g/kg/day C组，（氯沙坦组）:管饲氯沙坦25mg/kg/day， D组 (正常组)： 管饲与心肌康同等容积的生理盐水

3观察指标及测定方法

3．1.心肌标本的采集及处理  至用药30天，无菌室内无菌解剖取出心脏，滤纸吸干水分称重后沿左室长轴剪为两份。一份立即放入液氮中，后转入-70℃冰箱保存，以备提取RNA；另一份放入10%中性缓冲福尔马林液中固定，固定24小时后行组织学处理。 将组织不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片（厚度4µm），应用德国莱卡820-11型石腊切片机切片， 常规HE染色，苦味酸天狼猩红染色参照文献^[2]操作，光学显微镜下观察。应用德国莱卡公司偏光显微镜观察，日本尼康公司显微镜数码摄像系统（配置照相系统，胶卷用Kodar 100 ASA）照相。

3.2 心肌组织总RNA提取及CVB3-RNA定量测定：参照上海华舜生物有限公司提取RNA流程。CVB3-RNA定量测定采用RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）法：Nuclease-Free water 28µl， Amv/TfL5×缓冲液 10µl， dNTPsl 1µl，C1C2M1M2各1 ul， mgso₄ 2µl AMV逆转录酶1µl Tfl DNA 聚合酶1µl总RNA 3µl，总体积为50ul，加石蜡油35-40μl。48℃ 45逆转录反应，94℃ 2min使AVT RT失活RNA/cDNA变性，94℃×30sec 57℃×1′68℃×2min 40次循环，最后68℃延伸，7min，4℃浸泡，-20℃保存。取5µlPCR产物进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳（含0.5ug/ml溴化乙锭）分析，，并以100bp DNA marker为分子量标准，电泳缓冲液为1×TBE，电泳完成后在投射紫外线下观察并摄影。

所有RT-PCR照片均用美国TOOLLab VL.11图象处理系统，测定各产物条带密度，计算出CVB₃相对量（CVB₃条带密度与β-action条带密度之比值）。

4．统计学处 数据采用SPSS10.0统计分析软件处理，计算所有数据以均数（）±标准差（s）表示，组间比较采用方差齐性检验，单因素方差检验。

二 结果

1组织形态学观察

1．1 HE染色镜下观察正常组小鼠：心肌细胞结构清晰，肌纤维连接完整，无任何炎症浸润、坏死、心肌纤维化。VMC组小鼠：心肌内无淋巴细胞及心肌坏死，但可见明显的心肌纤维化，部分地方呈玻璃样变性，纤维化病灶与心肌相连。心肌康组、氯沙坦组与VMC组基本相同，但间质内增生的胶原纤维明显减少。

 1  2苦味酸天狼猩红染色-偏振光显象：VMC组小鼠心脏间质I、Ⅲ型胶原明显增生，其中I型胶原粗大呈亮红色或火红色，反复重叠，杂乱无序，呈团状，树枝状，乱草状排列，Ⅲ型胶原呈绿色，纤维较细，穿插分布于I型胶原中（见附图1），心肌康组小鼠心脏间质胶原较模型组明显减少，但仍可见黄红色的I型胶原及绿色的Ⅲ型胶原，且无明显的胶原连接，颜色逐渐变淡（见附图2）。氯沙坦组小鼠I、Ⅲ型胶原情况基本同于心肌康组，（见附图3正常组小鼠I、Ⅲ型胶原分布均匀，缠绕分布于心肌纤维周围，I、Ⅲ型胶原颜色亦较淡（见附图4）。     

               

四组小鼠心肌组织I、Ⅲ型胶原面积图象分析结果见表1

表1 各组小鼠心肌组织I、Ⅲ型胶原面积对比（±S）

组别	动物数	I型Ⅲ型胶原面积 （μ2）
正常组 VMC组	6 8	326.91±45.72 1426.75±114.40
心肌康组	8	726.60±64.78*
氯沙坦组	8	818.03±97.28*

注：与VMC组比较，*P＜0.01

从表1、可看出： 与正常组比较，VMC模型组I、Ⅲ型胶原面积明显多于正常组（P<0.01）；与VMC模型组比较，心肌康组与氯沙坦组I、Ⅲ型胶原面积明显减少（P<0.01）；心肌康组与氯沙坦组I、Ⅲ型胶原面积无统计学意义(P>0.05)。提示：心肌康有抑制胶原纤维增生，促进胶原降解的作用，其疗效与氯沙坦疗效相当。

2．RT-PCR法检测4组小鼠心肌内CVB₃RNA表达

四组小鼠心肌内CVB₃RNA表达水平的检测结果见表2

表2   四组小鼠心肌内CVB₃RNA表达（与β-action比值）