心肌康对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原影响的研究

王振涛^{1 #} 韩丽华¹ 尚东丽² 朱明军¹ 陈瑞珍³

摘要  目的：观察中药复方心肌康对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响，为其干预慢性心肌炎心肌纤维化提供实验依据。方法：将复制成功的慢性病毒性心肌炎小鼠随机分为VMC模型组、心肌康组、氯沙坦组，并设正常对照组，用药30天后，处死动物采用苦味酸天狼猩红染色方法偏振光显微镜观察心肌胶原含量的变化。结果：心肌康组心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原含量较VMC模型组明显减少，与氯沙坦组相比疗效相当（P>0.05）。结论：心肌康能抑制慢性病毒性心肌炎心肌胶原的增生，具有抗心肌纤维化的作用。河南省中医院心血管内科王振涛

 

关键词：心肌康  慢性病毒性心肌炎  心肌纤维化  Ⅰ、Ⅲ型胶原 

 

病毒性心肌炎是心血管系统常见病之一，好发于青少年，近年有增多的趋势。病毒性心肌炎患者经积极治疗后，大多数可痊愈，但部分患者可进入慢性期，导致病情缠绵难愈，大约有12.5%的患者可转化为扩张性心肌病而预后不良。研究表明，心肌间质胶原纤维增生是病毒性心肌炎慢性期的主要病理组织学改变^[1]，阻逆胶原增生、防止心肌纤维化是防止慢性病毒性心肌炎向扩张型心肌病转化的重要措施。本实验观察中药复方心肌康对小鼠病毒性心肌炎慢性期心肌胶原的影响，以探讨其作用机制。

材料及方法

1．材料

1.1 实验动物  清洁级Balb/c小鼠，3周龄，纯种，雄性，体重9～12g，上海医科大学动物中心提供，动物合格证号：01116。

1.2 病毒株  柯萨奇B₃（CVB₃；Nancy株)由上海中山医院卫生部病毒性心脏病重点试验室惠赠。在Hela-2细胞中传代，冻融离心三次，上清液分装，在Hela细胞测出50%组织感染率（TCID50）为10⁷,-70℃低温冰箱保存备用。实验用病毒量为100 TCID50。

1.3 实验药物

心肌康   由黄芪、西洋参、麦冬、五味子、丹参、苦参等组成。由河南省中医院制剂室按水煎剂工艺制成水煎剂，每毫升相当于生药2g。

氯沙坦钾片（科索亚） [国药准字X20000371]，50mg/片，由杭州默沙东制药有限公司生产，灌胃前用无菌双蒸水配制成浓度为2mg/ml的混悬药液。

1.4试剂 天狼猩红， 英国 Mobay Chemical公司生产；苦味酸、苏木精等均由上海华舜生物有限公司生产

1.5主要仪器：石腊切片机、偏光显微镜，德国莱卡公司；显微镜数码摄像系统（配置照相系统） 日本尼康公司； Toollab vL.11图象分析系统， 英国Thorepix公司；IMS 图象分析系统，上海申腾信息技术有限公司。

2．实验方法

2.1 动物模型的制作及分组

取3周龄、纯种、雄性、正常Balb/C小鼠300只，首次腹腔接种内含CVB₃ 100TCID50病毒稀释液0.1ml/只后常规饲养，后每隔15天腹腔接种同种浓度CVB₃病毒液0.1ml/只，共3次，50天以上成活小鼠为病毒性心肌炎慢性期模型，共115只，按照随机数字表法分为3组：A组为VMC组（38只）、B组为心肌康组（38只）、C组氯沙坦组（39只）。另设20只腹腔接种不含病毒的Eagle’s液小鼠为正常对照组（D组），接种方法及时间同上。

2.2 给药方法及用量:心肌康、氯沙坦用量均为成人剂量的15倍,一日一次灌胃。从造模第50天开始给药，共30天。B组（心肌康组）:管饲心肌康水煎剂15g/kg/day;C组（氯沙坦组）:管饲氯沙坦25mg/kg/day; A组（VMC组）、D组 (正常组)： 管饲与心肌康同等容积的生理盐水，生理盐水用量及灌胃时间同B、C组。

3．观察指标及测定方法

3.1实验动物取材  至用药30天，无菌解剖取出心脏，滤纸吸干水分称重后放入10%中性缓冲福尔马林液中固定，固定24小时后行组织学处理。

3.2  常规HE染色 将组织不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片（厚度4µm），脱腊，二甲苯透明，苏木素?伊红（HE）常规染色，光学显微镜下观察。

3.3  苦味酸天狼猩红染色?偏振光显微镜显像

具体操作过程：组织在中性缓冲福尔马林中固定→脱水、透明、浸蜡、包埋→切片（厚4µm）→二甲苯中彻底脱蜡→各级乙醇至水→0.1%苦味酸天狼猩红溶液染色1小时→流动自来水冲洗5分钟→各级乙醇内脱水→二甲苯透明→树胶封片。

封片后用偏光显微镜在40倍，20倍，10倍镜下拍摄观察，所有照片均用kodak100 ASA胶卷。组织切片用医学图象分析软件对胶原面积进行分析。分析方法是：每张切片在4倍物镜下按顺序移动统计5个视野，（每个视野相当于5000μm²  ）测出每个视野胶原的阳性面积，最后取其平均值。

4．统计学处理:数据采用SPSS10.0统计分析软件处理，以均数（）±标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

结果与分析

2．一般组织形态学观察

2．1 肉眼观察

正常组小鼠心脏颜色鲜红，无任何白色斑点。模型组小鼠心脏95%出现病变，外膜下可见白色点状、斑块状、条索状病变，尤其斑块居多。心肌康组小鼠病变以点状为主。而氯沙坦组有30%以斑块为主，70%以上以点状为主。

2．2 光镜观察

正常组小鼠：心肌细胞结构清晰，肌纤维连接完整，无任何炎症浸润、坏死、心肌纤维化。VMC组小鼠：心肌内无淋巴细胞及心肌坏死，但可见明显的心肌纤维化，部分地方呈玻璃样变性，纤维化病灶与心肌相连。心肌康组、氯沙坦组与VMC组基本相同，但间质内增生的胶原纤维明显减少。

3．苦味酸天狼猩红染色?偏振光显像

VMC组小鼠心脏间质I、Ⅲ型胶原明显增生，其中I型胶原粗大呈亮红色或火红色，反复重叠，杂乱无序，呈团状，树枝状，乱草状排列，Ⅲ型胶原呈绿色，纤维较细，穿插分布于I型胶原中（见附图1）。心肌康组小鼠心脏间质胶原较模型组明显减少，但仍可见黄红色的I型胶原及绿色的Ⅲ型胶原，且无明显的胶原连接，颜色逐渐变淡（见附图2）。氯沙坦组小鼠I、Ⅲ型胶原情况基本同于心肌康组。正常组小鼠I、Ⅲ型胶原分布均匀，缠绕分布于心肌纤维周围，I、Ⅲ型胶原颜色亦较淡。

四组小鼠心肌组织I、Ⅲ型胶原面积图象分析结果见表1。

 

表1  各组小鼠心肌组织I、Ⅲ型胶原面积对比（±S）

组别	动物数	I型Ⅲ型胶原面积 （μ2）
正常组 VMC组	6 8	326.91±45.72 1426.75±114.40
心肌康组	8	726.60±64.78*
氯沙坦组	8	818.03±97.28*

注：与VMC组比较，*P＜0.01

从表2、图2 可看出：与正常组比较，VMC模型组I、Ⅲ型胶原面积明显多于正常组（P<0.01）；与VMC模型组比较，心肌康组与氯沙坦组I、Ⅲ型胶原面积明显减少（P<0.01）；心肌康组与氯沙坦组I、Ⅲ型胶原面积无统计学意义(P>0.05)。

讨论

尸检或心内膜心肌活检证实^[1]，病毒性心肌炎慢性期主要病理解剖特点为心脏间质纤维化，主要表现为Ⅰ、Ⅲ型胶原在心脏间质内大量沉积，进而影响心脏的收缩和舒张功能，而成为发展成扩张型心肌病的重要病理机转。

我们通过长期临床观察发现，气阴耗伤，血瘀阻络，热毒残留是慢性心肌炎迁延不愈形成心肌纤维化，发展成扩张型心肌病的重要病理机制。由此提出益气养阴，佐以活血通络、清热解毒的重要治法，拟方心肌康，全方由黄芪、西洋参、麦冬、五味子、丹参、苦参等组成，临床应用取得了显著的效果。

天狼猩红是一种很强的酸性染料，它可以与胶原反应并大大增强胶原的折光现象，可以提高分辨率，因而它是目前对胶原染色最好的染料。胶原在经苦味酸天狼猩红染色后，在偏光镜下Ⅰ型胶原纤维呈强双折射的红色或黄色的粗纤维，Ⅲ型胶原呈弱双折射的绿色细纤维，随着胶原的多少及纤维化的程度，颜色可有改变。因此我们利用此技术观察心肌康对实验性心肌纤维化小鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响。

在本实验中观察到在正常组的心肌组织中Ⅰ型Ⅲ型胶原纤维的含量并不多，且颜色较淡，VMC组小鼠心脏胶原成份明显增多，可看到火红粗大的Ⅰ胶原反复重叠成乱草样排列，Ⅲ型胶原成绿色穿插于Ⅰ型胶原中，由此可诊断VMC小鼠心肌发生了明显的心肌纤维化。经图象分析及统计学处理，四组小鼠按胶原面积多少排列顺序为VMC组＞心肌康组=氯沙坦组＞正常组。由此可见氯沙坦和心肌康均能有效抑制小鼠胶原的过度表达。但其作用机理不尽相同，氯沙坦主要是通过拮抗血管紧张素ⅡAT₁受体而抑制心脏间质胶原的合成。根据心肌康现代药理研究，推测心肌康抗VMC慢性期心肌纤维化原因主要是从根本上抑制病毒复制，阻断病毒感染所触发的进行性心脏损伤??心肌细胞变性、坏死、细胞间质广泛心肌纤维化。关于心肌纤维化形成机理，现代研究认为^[2]病毒在心肌中的持续存在可直接损伤心肌细胞，触发免疫反应，导致细胞因子和NO的释放，激发进行性心肌损伤??引起心肌变性坏死及心肌纤维化形成。现代药理研究表明：黄芪具有抗病毒作用，可减少CVB₃感染小鼠继发性心肌损伤，恢复损伤的心肌细胞活性，对VMC向DCM转化起逆转作用^[3]；西洋参总皂甙具有扩张冠状动脉，改善心肌缺血，提高心肌收缩功能，减慢心率，增强心肌细胞代谢，从而改善心功能^[4]；麦冬、五味子具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，增加心肌收缩力，降低外周阻力，改善心肌能量代谢，提高机体抗缺氧能力的作用；丹参具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，改善心肌缺血、调整心律，抑制胶原增生，抗心肌纤维化^[5]，促进疤痕组织吸收，促进受损心肌修复等作用^[6]。苦参有抗病毒，降低心肌收缩力，减慢心率，延缓房性传导及降低自律性作用^[7]。故可推测，心肌康除有抑制病毒复制作用外，还通过直接降解胶原纤维，调节免疫机制，抗脂质过氧化等作用，抑制胶原的过度增生。其中有关心肌康通过拮抗血管紧张素ⅡAT₁受体而抑制胶原增生的研究已有结果，将另文发表。

参考文献

1.   李广生,主编.心肌病理学.第1版.上海:科学技术出版社,1985:174

2.   杨英珍，主编.病毒性心脏病.第1版.上海. 上海. 科学技术出版社,2001:29

3.   陈相健,陆曙,耿茜,等.黄芪总皂或对病毒性心肌炎小鼠慢性期SERCA活性的影响.江苏医药杂志,2000,26 (10):757-760

4.   罗智博.益气通脉法治疗病毒性心肌炎临床观察. 辽宁中医杂志,2002,29（2）：85-86

5.   孙联平, 熊玮, 郑智.丹参对自发性高血压大鼠左室肥厚及心肌Ⅰ型和III型胶原的影响.中华新医学,2003,4（6）：481-483

6.   俞美玉.中药为主治疗12例小儿病毒性心肌炎.上海中医药杂志,1985,（11）：15

7.   陈福祥,刘晶星,陆德源. 苦参总碱抗柯萨奇B病毒3型作用测定及其机理的初步研究. 中华实验和临床病毒学杂志, 1995,39（2）：15-16