心肌康对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响

摘要  目的：观察中药复方心肌康对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响，为其干预慢性心肌炎心肌纤维化提供实验依据。方法：将复制成功的慢性病毒性心肌炎小鼠随机分为VMC模型组、心肌康组、氯沙坦组，并设正常对照组，用药30天后，处死动物观察心肌胶原mRNA表达的变化。结果：心肌康组心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达较VMC模型组明显减少，与氯沙坦组相比无统计学意义。结论：心肌康能抑制慢性病毒性心肌炎心肌胶原的增生，具有抗心肌纤维化的作用。河南省中医院心血管内科王振涛

 

关键词：心肌康  慢性病毒性心肌炎  心肌纤维化  Ⅰ、Ⅲ型胶原 

 

Study of Xinjikang on the mRNA expression of Ⅰ、Ⅲ collagens of chronic viral myocarditis mice

WANG Zhentao¹,HAN Lihua¹,SHANG Dongli²,ZHU Mingjun¹,CHEN Ruizhen³

(1,Henan provincal TCM hospital,Zhengzhou,Henan,450002;2,Nanyang city people hospital,Nanyang,Henan,473061;3,Zhongshan hospital cardiopathy laboratory of Fudan university medical college,Shanghai,China,200032.)

                        Abstract   

Objective:to observe myocardiumⅠ、Ⅲ collagens mRNA distinct expression of Xinjikang on chronic viral myocarditis mice and to provide the experimental foundation for Xinjikang interfering chronic myocarditis myocardium fibrosis.Methods:the mice duplicated chronic viral myocarditis succeedly were randomly divided into VMC group,Xinjikang group and losartan group,normal mice were contral group.After the 30 days’medication intervention,the mice were killed to observe the content change of myocardium collagen.Results:compared with VMC group, Ⅰ、Ⅲ collagens mRNA expression  obviously reduced in Xinjikang group,but no statistics signifecance vs losartan group.Conclusion:Xinjikang can refrain the myocardium collagen proliferation of chronic viral myocarditis,so Xinjikang has the role of resisting fibrosis.

 

Key words:  Xinjikang  chronic viral myocarditis   myocardium fibrosis  Ⅰ、Ⅲ collagens

 

病毒性心肌炎是心血管系统常见病之一，好发于青少年，近年有增多的趋势。病毒性心肌炎患者经积极治疗后，大多数可痊愈，但部分患者可进入慢性期，导致病情缠绵难愈，大约有12.5%的患者可转化为扩张性心肌病而预后不良。研究表明，心肌间质纤维增生是病毒性心肌炎慢性期的主要病理组织学改变^[1]，阻逆心肌纤维化是防止慢性病毒性心肌炎向扩张型心肌病转化的重要措施。本实验观察中药复方心肌康对小鼠病毒性心肌炎慢性期心肌胶原的影响，从分子水平探讨心肌康的作用机制。

材料及方法

1．材料

1.1 实验动物  清洁级Balb/c小鼠300只，3周龄，纯种，雄性，体重9～12g，上海医科大学动物中心提供，动物合格证号：01116。

1.2 病毒株  柯萨奇B₃（CVB₃；Nancy株)由上海中山医院卫生部病毒性心脏病重点试验室惠赠。在Hela-2细胞中传代，冻融离心三次，上清液分装，在Hela细胞测出50%组织感染率（TCID50）为10⁷,-70℃低温冰箱保存备用。实验用病毒量为100 TCID50。

1.3 实验药物

心肌康   由黄芪、西洋参、麦冬、五味子、丹参、苦参等组成。由河南省中医院制剂室按水煎剂工艺制成水煎剂，每毫升相当于生药2g。

氯沙坦钾片（科索亚） [国药准字X20000371]，50mg/片，由杭州默沙东制药有限公司生产，灌胃前用无菌双蒸水配制成浓度为2mg/ml的混悬药液。

1.4试剂 RNAex Reayent systemI，上海华舜生物有限公司生产；Access RT-PCR System          美国 promega 公司；100bp DNA Marker 上海华舜生物有限公司生产；各引物                        上海生工生物技术公司生产，引物序列如下：I型胶原 上游 5´-TGT TCG TGG TTC TCA GGG TAG-3´  下游 5´-TTG TCG TAG CAG GGT TCT TTC-3´扩增产物大小为245bp；Ⅲ型胶原 上游 5´-TGC CCA CAG CCT TCT ACA CCT-3´ 下游 5´-CAG CCA TTC CTC CCA CTC CAG-3´ 扩增产物大小为254bp；β-action 上游 5´-GTC ACC CAC ACT GTG CCC ATC T-3´   下游 5´-ACA GAG TAC GCG CTC AGG AG-3´扩增产物大小为542bp。

1.5主要仪器：核酸蛋白测定仪 德国Eppendorf公司；梯度PCR仪  德国Eppendorf公司；显微镜数码摄像系统（配置照相系统）日本尼康公司；DY?A 电泳仪 上海康达电子仪器厂；凝#胶图象及显微镜摄像系统 美国CTS公司；Toollab vL.11图象分析系统 英国Thorepix公司。

2．实验方法

2.1 动物模型的制作及分组

取3周龄、纯种、雄性、正常Balb/C小鼠300只，首次腹腔接种内含CVB₃ 100TCID50病毒稀释液0.1ml/只后常规饲养，后每隔15天腹腔接种同种浓度CVB₃病毒液0.1ml/只，共3次，50天以上成活小鼠为病毒性心肌炎慢性期模型，共115只，按照随机数字表法分为3组：A组为VMC组（38只）、B组为心肌康组（38只）、C组氯沙坦组（39只）。另设20只腹腔接种不含病毒的Eagle’s液小鼠为正常对照组（D组），接种方法及时间同上。

2.2 给药方法及用量:心肌康、氯沙坦用量均为成人剂量的15倍,一日一次灌胃。从造模第50天开始给药，共30天。B组（心肌康组）:管饲心肌康水煎剂15g/kg/day;C组（氯沙坦组）:管饲氯沙坦25mg/kg/day; A组（VMC组）、D组 (正常组)： 管饲与心肌康同等容积的生理盐水，生理盐水用量及灌胃时间同B、C组。

3．观察指标及测定方法

3. 1  心肌组织总RNA提取：

提取RNA总的流程如下：心肌组织30mg+1mlRNAex Reagent

  ↓匀浆

15℃-30℃×5min

↓

加200µl氯仿

     ↓剧烈振荡

15-30℃×3min

↓

≤12000g×15min(2-8℃)

→小心吸取上层水相（含RNA）

↓

加500µl异丙醇

↓振荡后

15-30℃×10min

↓

≤12000g×5min(2-8℃)

↓

75%酒精洗

↓

 ≤7,500g×5min（2-8℃）

↓沉淀干燥

30µl无RNA酶水溶解，-70℃冰箱保存备用

3. 2 RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达：

Ⅰ型胶原引物或Ⅲ型胶原引物及β-action引物同时加入，PCR反应模板为3ul。

反应条件：48℃×45′→94℃×2′→（94℃×30″→55℃×1′→68℃×2′）×40cycles→68℃×7′→4℃×∝（扩增I型胶原和β-action）

48℃×45′→94℃×2′→（94℃×30″→55℃×1′→68℃×2′）×40cycles→68℃×7′→4℃×∝（扩增Ⅲ型胶原和β-action）

所有RT-PCR照片均用英国TOOLLab VL.11图象处理系统，测定各产物条带密度，计算出Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对量（Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA条带密度与β-action条带密度之比值）。

4．统计学处理:数据采用SPSS10.0统计分析软件处理，以均数（）±标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

结果与分析

1．小鼠心肌提取出总RNA鉴定：各组心肌组织提取出之总RNA，用紫外分光度计测定OD₂₆₀与OD₂₈₀的比值在1.8-2.0之间，说明提取之RNA纯度高，可用于RT-PCR。

2．RT-PCR检测4组小鼠心肌内I、及Ⅲ型胶原mRNA

根据背景材料，Ⅰ、Ⅲ型胶原及β-action的扩增产物片段应分别为245bp、254bp、542bp，经1.5%琼脂糖电泳后，与Marker比较，PCR产物片段长度与预期结果一致，说明PCR产物符合背景材料。（见附图1、2）

6.1  RT-PCR检测4组小鼠心肌内I型胶原mRNA统计结果见表1、图1。

 

 

 

 

表1   四组小鼠心肌内I、Ⅲ型胶原mRNA表达（与β-action比值）