抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

王振涛¹，韩丽华¹，朱明军²，曹程浩¹，柴松波¹

（1河南省中医院心血管病研究室  河南郑州 450011；2河南中医学院第一附属医院心脏中心 河南郑州 450003）

摘要    目的：观察抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响，并探讨其机制。方法：雄性Wistar大鼠，喂饲呋喃唑酮水溶液建立扩张型心肌病动物模型，随机分为卡托普利对照组、抗纤益心方大剂量组、抗纤益心方小剂量组、中西药联用组、模型组。药物干预8周后，处死动物。用TUNEL法检测心肌凋亡细胞形态学的改变；免疫组化法观察心肌Bcl-2、Bax蛋白表达，用病理图像分析系统测定Bcl-2、Bax蛋白表达平均光密度值并进行半定量分析。结果：(1)各组心肌细胞凋亡指数的比较：中西药联用组、大剂量组、卡托普利组、小剂量组与模型组比较有显著差异（P<0.05），其中以中西药联用组减少凋亡最明显；中西药联用组与大剂量组、卡托普利组、小剂量组比较有显著差异（P<0.05）；大剂量组和卡托普利组作用相似（P>0.05）。(2)各组Bax、Bcl-2蛋白阳性表达的比较：中西药联用组、大剂量组和卡托普利组与模型组相比Bax蛋白阳性表达有所上升（P<0.05）；中西药联用组、大剂量组、卡托普利组、小剂量组与模型组相比Bcl-2蛋白表达有所下降（P<0.05）；与模型组相比，中西药联用组、大剂量组和卡托普利组均能明显下调Bax蛋白表达（P<0.05），上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05），但中西药联用组、大剂量组和卡托普利组作用相似（P>0.05）。结论：抗纤益心方有抑制或减少扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡的作用，其机制与下调Bax蛋白表达、上调Bcl-2蛋白表达有关。河南省中医院心血管内科王振涛

关键词：抗纤益心方；扩张型心肌病；心肌细胞凋亡；分子机制；实验研究

【Abstract】Objective:To expound the mechanism of Kangxianyixin prescription on prevention on morphology of cardiomyocyte apoptosis and change of Bax and Bcl-2 expression indexes in rats with dilated cardiomyopathy. Methods: Furazolidone was rised to establish Dilated Cardiomyopathy in wistar rats，which were treated 8 weeks with Kangxianyixin prescription, To observe Cardiomyocyte Apoptosis with TUNEL method and to measure Bax and Bcl-2 expression indexes in rats with dilated cardiomyopathy with immunohistochemistry techenique. Results: (2) In comparison of cardiomyocyte apoptosis indexes in rats, when compared with the model group, the results showed significant difference in the combined group of high dosage of Kangxian Yixin Prescription and captopril , the high dosage group, the low dosage group, the captopril group , among which the effect of the high dosage and captopril group was best; there was difference between the group of combined high dosage and captopril and other groups(except the normal group) while no difference between the high dosage group and the captopril group；(3) In comparison of Bax and Bcl-2 gene expression, there was higher expression about Bax of the model group than the normal group, the high dosage and captopril group,the high dosage of Kangxian Yixin Prescription group and the captopril group; the expression about BCL-2 was lower in the model group than others; compared with the model group，the high dosage and captopril group, the high dosage group and the captopril group could dramatically lower Bax gene expression and increase Bcl-2 gene expression，while there was no statistical significance between the high dosage and captopril group, the high dosage group and captopril group.

【key words】Kangxian Yixin Prescription；dilated cardiomyopathy；cardiac muscle apoptosis； experiment research.

细胞凋亡是指在活体组织中，某一细胞在一定体内外因素影响下通过其自身基因调控而发生能量依赖型的一种细胞主动死亡过程。是有机生物体通过激活细胞自身编码的自杀程序调节细胞死亡以期维持与自身细胞增生相平衡的一种方式。近年研究发现，扩张型心肌病在心肌损伤中有细胞凋亡机制参与^[1-3]。本研究观察抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡的影响，并通过观察扩张型心肌病大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化探讨其机制。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验用药　抗纤益心方干浸膏(由党参，黄芪，云苓，白术，丹参，川芎，红花，赤芍，泽兰，益母草组成)：由河南省中医院制剂室提供，每克浸膏相当于生药4g；呋喃唑酮片：福建省三明天泰制药有限公司生产，批号：20050204；卡托普利片：常州制药厂生产，批号：200502242；戊巴比妥钠：中国医药（集团）上海化学试剂公司生产，批号：F20021216。

1.1.2实验试剂  原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物工程有限公司；抗Bax抗体、抗Bcl-2抗体，购自武汉博士德生物工程有限责任公司。

1.1.3实验器材  石蜡切片机(德国莱卡公司，型号SM-2000R）；摄影显微镜（德国莱卡公司）；光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；Toollab vl.11图像分析系统（德国莱卡公司）；JY-1001型精密电子天平（上海民桥电子仪器厂）；ECG-695ED光电心电图机（上海光电仪器设备厂）。

1.2动物造模及分组  选取体重为61.9g±7.0g的Wistar雄性大鼠(郑州大学动物中心提供，合格证号：510116。把动物按5：1随机分为模型组和正常对照组。参照文献方法^[4]，模型组在饮水中加呋喃唑酮 (按1Kg水加700mg呋喃唑酮配置) 喂养，喂养8周。正常组动物常规饲养，不进行药物干预。

1.3治疗方法  造模8周后开始药物干预，每天一次给药。正常组动物常规饲养，不进行药物干预；模型组动物每日管饲与治疗组同等容积的生理盐水；抗纤益心方治疗小剂量组动物每日管饲抗纤益心方4.7g/kg/d；抗纤益心方治疗大剂量组动物每日管饲抗纤益心方18.8g/kg/d；卡托普利对照组动物每日管饲卡托普利10.125mg/Kg/d；中西药联用组动物同时管饲卡托普利及抗纤益心方大剂量。8周后处死动物。

 1.4心肌取材  动物麻醉后，迅速打开胸腔，取出心脏，滤纸吸干水分称重后从心尖处沿冠状面切取心肌组织两份，一份放入10%中性缓冲福尔马林液中固定，石蜡包埋，制备厚4μｍ组织切片；另一份立即放入液氮中，后转入-70℃冰箱保存，以备它用。

1.5观察指标

1.5.1一般组织形态学观察  切片脱腊，二甲苯透明，HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固，光镜观察。

1.5.2大鼠心肌细胞凋亡指数的测定  用TUNEL法染色组织切片。光镜下，细胞核中显棕黄色阳性颗粒者为凋亡细胞。每只大鼠观察5张切片，在图像分析系统上随机选取相等的5个高倍镜视野(×400)，然后在计数网格上数出凋亡细胞阳性颗粒个数及细胞总数，计算凋亡细胞占总细胞数的百分率为凋亡指数，每张片子取其平均值。

1.5.3 Bax、Bcl-2蛋白表达平均光密度值（OD）的测定  用免疫组化法染色组织切片。光镜下，各组Bax和Bcl-2的阳性染色呈棕黄色或棕褐色，阳性区域主要分布于心肌细胞胞浆。每只大鼠观察5张切片，在图像分析系统上随机选取相等的5个高倍视野(×400)，测定OD值，每张片子测量后取平均值。

1.6统计学方法  数据用SPSS13.0 For Windows统计分析软件处理，计算所有数据以均数±标准差( )表示，组间比较采用单因素方差分析。

2结果

2.1一般组织形态学观察 

正常组心肌纤维排列整齐，细胞核大小、形态基本一致，染色质均匀，未见肥大、坏死、萎缩、断裂等现象，未见间质细胞增生；模型组心肌内可见明显的心肌纤维化，心肌组织结构松弛，间质纤维化与心肌相连；中西药联用组心肌细胞结构清晰，肌纤维连接完整，无坏死，心肌纤维化少见；大剂量组心肌细胞结构清晰，间质纤维组织增生不明显，心肌组织结构稍松弛，细胞核肥大，异型不明显。间质内增生的胶原纤维较模型组明显减少；小剂量组、卡托普利组基本相同，间质内增生的胶原纤维较模型组明显减少，心肌组织结构松弛明显，但较模型组明显改善。

2.2各组心肌细胞形态学及凋亡指数的比较        

光镜下，细胞核中显棕黄色阳性颗粒者为凋亡细胞。结果显示，正常组无凋亡细胞；模型组大鼠心肌细胞核内可见到较多棕黄色核染，且细胞核皱缩不规则，显示出较多凋亡细胞的特征；所有给药组细胞凋亡均有不同程度的下降，其中中西药联用组、卡托普利组和大剂量组的下降程度尤为明显，与模型组相比较有统计学意义(P<0.05)，而大剂量组和卡托普利组作用相似（P>0.05）。各给药组减少心肌细胞凋亡的作用强度依次为：中西药联用组、卡托普利组、大剂量组、小剂量组。各组心肌细胞凋亡和凋亡指数比较结果见附图1和表1。

表1 各组凋亡指数的比较（ ）

组别	N	凋亡细胞指数（％）
正常组 模型组	15 10	0 19.380±2.366
卡托普利组	13	7.942±1.427△
大剂量组	14	8.241±1.158△
小剂量组	11	12.643±2.156△
中西药联用组	14	2.245±0.876△

注：与模型组相比，△P<0.05

 

2.3各组Bax、Bcl-2蛋白阳性表达的比较

光镜下，各组Bax和Bcl-2的阳性染色呈棕黄色或棕褐色，阳性区域主要分布于心肌细胞胞浆。结果显示，正常组、中西药联用组、大剂量组和卡托普利组与模型组相比Bax蛋白阳性表达有所上升（P<0.05）；其余各组与模型组相比Bcl-2蛋白表达有所下降（P<0.05）；中西药联用组、卡托普利组和大剂量组则明显下调Bax蛋白表达（P<0.05），上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05），其中以中西药联合组此作用最强，但与大剂量组和卡托普利组相比，无统计学意义（P>0.05）。各组Bax、Bcl-2蛋白表达（附图2、3）OD值比较结果见表2。

 

 

 

 

 

 

表2 各组Bax、Bcl-2蛋白OD值的比较（ ）

组别	N	Bax蛋白OD值	Bcl-2蛋白OD值
正常组 模型组	15 10	103.807±2.673 124.255±4.586	91.238±1.119 100.987±3.096
卡托普利组	13	114.905±2.885*	115.142±2.257*△
大剂量组	14	113.113±3.517*△	112.868±2.577*△
小剂量组	11	120.027±2.645*	111.157±1.084*△
中西药联用组	14	108.735±7.825△	111.157±1.084*△

注：与正常组相比，*P<0.05；与模型组相比，△P<0.05

3讨论

细胞凋亡为普遍存在的一种生物现象，贯穿于机体整个生命活动过程的基本生理机制，调节着机体细胞增殖与更新间的平衡，维持组织器官正常生理功能及细胞数量的稳定，某些致病因子可以使细胞凋亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，从而破坏了机体细胞的自稳态，最终表现为疾病的发生。凋亡相关调控基因的表达直接决定着细胞凋亡的发生与否。研究表明Bcl-2和Bax基因是主要的调控基因，Bcl-2抑制细胞凋亡，Bax促发细胞凋亡^[5]。

扩张型心肌病是一种原因不明的心肌疾病，其主要特征是心脏扩大和心肌收缩功能减低。近年来研究表明晚期扩张型心肌病心肌细胞凋亡明显增多^[6,7]。冯震博等^[3]研究发现扩张型心肌病早中期已有明显的细胞凋亡发生，并且随着心脏增大，心力衰竭加重，又进一步加重心肌细胞凋亡程度形成恶性循环。提示凋亡是扩张型心肌病的心肌细胞丢失和心功能不全的重要机制。

扩张型心肌病属中医“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“喘证”、“水肿”等病范畴，其发生是内外因共同作用的结果，从而形成的本虚标实之证，早期气虚为本，瘀血为标。晚期心肾阳气虚衰，导致诸脏腑功能失调。而气虚血瘀是本病病机关键之所在，存在于病变发展过程中的各个环节。有证据表明^[8,9]，临床上应用益气活血法能改善扩张型心肌病的临床症状、体征和心功能。因此益气活血法应贯穿于本病治疗的始终。

本研究发现模型组心肌细胞凋亡数量明显高于正常组，提示心肌细胞凋亡参与了扩张型心肌病后左室重构的形成，是造成扩张型心肌病的机制之一。应用抗纤益心方和卡托普利后心肌细胞凋亡指数均有不同程度下降。通过对Bax、Bcl-2蛋白表达OD值的测定，与模型组相比，中西药联用组、卡托普利组和大剂量组则明显下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达；抗纤益心方小剂量组与模型组相比明显上调Bcl-2蛋白表达，但下调Bax蛋白表达不明显。提示抗纤益心方能通过下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达而抗扩张型心肌病后心肌细胞的凋亡。有报道，ACEI有通过使Bcl-2/Bax基因表达比率恢复正常来减少心肌细胞凋亡发生的作用^[10－11]，故选ACEI类中的卡托普利作为对照，结果与报道相一致。尽管抗纤益心方能下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，但其机理是什么？用药时间多长为宜？最佳有效剂量是多少？均有待进一步深入研究。

 

参考文献

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河南省高校新世纪优秀人才支持计划（编号：2005HANCET-07）