抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响

王振涛¹，韩丽华¹，朱明军²，柴松波¹，曹程浩¹

（1河南省中医院心血管病研究室  河南郑州 450011；2河南中医学院第一附属医院心脏中心 河南郑州 450003）

 (The cardiovascular diseases laboratory in traditional Chinese medicine hospital of Henan Province,Zhengzhou ,Henan 450011)河南省中医院心血管内科王振涛

【摘要】 目的：探讨抗纤益心方抑制扩张型心肌病（DCM）大鼠心室重构的机制。方法：采用自主饮用呋喃唑酮水溶液建立DCM大鼠模型，抗纤益心方干预8周，处死动物。用免疫组化法检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。结果：模型组心肌间质内Ⅰ、Ⅲ型胶原大量增生，与正常组比较有显著差异性（P<0.05）；中西药联用组、大剂量组心肌内Ⅰ、Ⅲ型胶原较模型组明显减少（P<0.05）；大剂量组与卡托普利组比较无差别（P>0.05），与小剂量组比较有统计学意义（P<0.05）。结论：DCM大鼠心肌呈明显纤维化，与Ⅰ、Ⅲ型胶原在心肌组织内较高的表达存在密切关系。抗纤益心方能够抑制心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，从而起到抑制心室重构的作用。

【关键词】抗纤益心方；扩张型心肌病；心室重构；Ⅰ、Ⅲ型胶原；免疫组化法

【Abstract】Objective:To expound the mechanism of Kangxianyixin prescription on prevention on cardiac muscle remodeling after Dilated Cardiomyopathy. Methods: Furazolidone was rised to establish Dilated Cardiomyopathy in wistar rats，which were treated 8 weeks with Kangxianyixin prescription, To measure tapeⅠand type Ⅲ collagen gene expression in cardiac myocytes with immune tissuechemical method. Results: There is higher expression in the model group compared with the normal group. There is significant difference between the high dosage group and the model group, There is no difference between the high dosage group compared with the captopril group. There is meaning in the low group compared with the high dosage group. Conclusion: Kangxianyixin prescription can mitigate signs and symptoms,low down the pathologic damage. All these functions may be related to lowering the levels of neuroendocrine indexes and resisting tapeⅠand type Ⅲ collagen gene expression.

【key words】Kangxianyixin Prescription；Dilated Cardiomyopathy； ventricular remodeling； tapeⅠand type Ⅲ collagen；immune tissuechemical method.

扩张型心肌病[Dilated Cardiomyopathy，DCM]是一种以左心室和（或）右心室心腔扩大、心肌收缩功能障碍为主要特征的心肌疾病。也是除冠心病和高血压以外导致心力衰竭的主要病因之一。其临床常表现为进行性心力衰竭、心律失常、血栓栓塞甚或猝死，可见于病程中任何阶段，至今尚无特异性治疗方法，预后极差，据统计，其5年生存率不及50％^[1-2]。尽管近年来心血管病诊疗技术取得不少进展，但DCM患者的预后仍不容乐观。我们根据扩张型心肌病发病过程中多有气虚血瘀的病理特点，自拟具有益气、活血、利水作用的抗纤益心方治疗扩张型心肌病，在临床上获得了好的疗效。本研究采用动物实验方法观察其对扩张型心肌病大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响，从而探讨其抑制DCM心室重构的作用机制，为临床运用提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1材 料

动物：Wistar大白鼠100只，雄性，体重(61.9±7.0)g，由河南省实验动物中心提供（动物合格证号：510116）。

药物与试剂：抗纤益心方干浸膏(党参，黄芪，云苓，白术，丹参，川芎，红花，赤芍，泽兰，益母草)：由河南省中医院制剂室提供，每克浸膏相当于生药4克；呋喃唑酮：福建省三明天泰制药有限公司，30mg/片，批号：20050204；卡托普利：常州制药厂提供, 25mg/片，批号：200602242。兔抗鼠Ⅰ型多克隆抗体，美国Stan Cluz公司产品；兔抗鼠Ⅲ型多克隆抗体，美国Stan Cluz公司产品；SP9002山羊抗鼠二抗试剂盒，北京中杉生物工程有限公司。

仪器：CH20B1MF－200型显微镜，日本Olympus光学有限公司；显微镜数码摄像系统，日本尼康公司；JY-1001型电子天平，上海民桥电子仪器厂。

1.2方 法

1.2.1分组与模型制备

参照文献方法^[3]，将100只Wistar健康雄性大白鼠，采用随机方法按5:1先分为造模组和正常组。造模组自主服用呋喃唑酮水溶液(按1Kg水加700mg呋喃唑酮配置)，每日更换一次。造模时间为8周。8周后再将存活的造模组大鼠随机分为五组，分别为中西药联用组、模型组、抗纤益心方治疗大剂量组、抗纤益心方治疗小剂量组、卡托普利对照组，每组14只。

1.2.2给药方法

    正常组动物常规饲养，不进行药物干预；模型组每日管饲与治疗组同等容积的生理盐水；卡托普利对照组每日管饲卡托普利10.125mg/Kg?d；抗纤益心方治疗大剂量组每日管饲抗纤益心方18.8g/kg?d；抗纤益心方治疗小剂量组每日管饲抗纤益心方4.7g/kg?d；中西药联用组每日管饲抗纤益心方大剂量和卡托普利。各治疗组均于自主服用呋喃唑酮水溶液8周即开始药物干预，抗纤益心方大、小剂量和对照药卡托普利均用生理盐水稀释，在保证药物剂量的前提下，调整浓度使每组给药容积均为1ml/100g/d，管饲给药。管饲的毫升数每组一致，同时模型组、卡托普利对照组、抗纤益心方治疗大剂量组、抗纤益心方治疗小剂量组、中西药联用组继续自主服用呋喃唑酮水溶液以保证致病因素的持续存在，16周后处死动物，进行各指标的观察。

1.2.3标本采集

动物麻醉后，迅速打开胸腔，取出心脏，滤纸吸干水份，全心称重。剪去左、右心房及右心室称左室重量。然后从心尖处沿冠状面切取心肌组织，称重为200mg左右，放入10%中性缓冲福尔马林液中固定，24小时后行组织学处理。

1.2.4标本测定

    用免疫组织化学技术（SP法）染色组织切片，然后定量检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原积分光密度值。兔抗鼠Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原多克隆抗体的工作浓度均为1:50。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

每组随机抽取6张切片，每张选取6个视野，在400倍光镜下观察，测定标本阳性区平均积分光密度，计算出Ⅰ、Ⅲ型胶原相对量。

1.2.5统计学方法

数值用均数±标准差（ ）表示，SPSS 11.0软件计算，结果之间的比较用单因素方差分析。

2 结果

免疫组化（SP法）检测大鼠心肌内Ⅰ、Ⅲ型胶原积分光密度值

正常组心肌细胞间质中有少量Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，且颜色较淡（见图1，2  A₁、A₂）；模型组心肌细胞间质中有大量胶原表达，可看到棕黄色的Ⅰ、Ⅲ型胶原反复重叠排列（见图1，2  B₁、B₂）；卡托普利组、大剂量组、中西药联用组心肌细胞间质中有Ⅰ、Ⅲ型胶原增生，但心肌间质内增生的胶原纤维较模型组明显减少（见图1，2  C₁、C₂；D₁、D₂；F₁、F₂）；小剂量组心肌细胞间质中有大量胶原表达，可看到棕黄色的Ⅰ、Ⅲ型胶原重叠排列；但心肌间质内增生的胶原纤维较模型组减少（见图1，2  E₁、E₂）。Ⅰ、Ⅲ型胶原积分光密度值比较见表1。

表1  SP法检测各组大鼠心肌内Ⅰ、Ⅲ型胶原积分光密度值（ ）

组  别            N         Ⅰ型胶原             Ⅲ型胶原

正 常 组            6         81.00±1.76           86.44±6.31

模 型 组            6         121.39±8.41         110.93±4.13

卡托普利组          6         94.90±3.36 ^#△         98.99±3.27^#△

大剂量组            6         92.35±5.11^#           97.08±4.18^#

小剂量组            6         113.27±7.42^△        104.65±5.30^△

中西药联用组        6         83.67±2.54^#          90.27±4.64^#

 

 

 

 

 

 

 

注：经单因素方差分析，与正常组比较，^△P＜0.05；与模型组比较，?P＜0.05。

3讨 论

心室重构是扩张型心肌病导致心力衰竭的病理过程。扩张型心肌病心衰时为适应心脏负荷的增加，心室肌及心室肌间质在细胞结构、功能、数量及遗传表型方面所出现的适应性、增生性的变化即为扩张型心肌病心室重构病理生理学基础。有研究表明^[4]细胞外基质重塑是导致扩张型心肌病心室重构发生发展的重要因素，细胞外基质对扩张型心肌病患者预后有重要预测价值。其中心肌细胞外基质的主要成分是心肌胶原网络。Ⅰ型和Ⅲ型胶原是构成心脏胶原网络的主要成分^[5]。Ⅰ型胶原主要聚合成粗纤维，其伸展和弹性较小，僵硬度较大，有很强的抗牵拉特性而用于保持室壁的强度；Ⅲ型胶原主要形成细纤维，其伸展和回弹性较大，与室壁弹性有关^[6-7]。Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维是正常及病理心肌间质网络的主要成分。病理性心肌重塑时，实质与间质不成比例(后者增多)增生是引起心功能由代偿转向失代偿及心衰的重要原因之一。

一般认为，DCM有症状阶段属中医“惊悸、怔忡”、“胸痹”、“心痛”、“喘证”、“水肿”等病范畴，其发生是内外因共同作用的结果，形成本虚标实之证，早期气虚为本，瘀血为标；晚期心肾阳气虚衰，导致诸脏腑功能失调。其中气虚阳虚为本，瘀血、痰浊、水湿为标。而气虚血瘀是本病病机关键之所在，存在于病变发展过程中的各个环节，故益气活血法应贯穿于本病治疗的始终。抗纤益心方是笔者在临床上应用于治疗DCM、各种原因所致的心力衰竭等病症属气虚血瘀证的一个经验方。在改善症状，延缓和逆转心室重构方面起到了积极作用，为一临床疗效肯定的方剂。

我们的研究结果显示，抗纤益心方能够减轻DCM大鼠心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原增生，左室重构程度明显减轻，与卡托普利有相似的抑制心室重构作用。而中西药联用组较单用抗纤益心方大剂量和卡托普利效果更好，表明抗纤益心方和卡托普利在减少DCM大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原量的合成方面有相加作用。其作用机理是否通过直接降解胶原纤维，调节免疫机制，抗脂质过氧化等作用来抑制胶原的过度增生，还有待进一步探讨。

参考文献

1.Richardson P, McKenna W, Bristow W, etal. Report of the 1995 World Health Organization/International Society and Federation of Cardiology Task Force on the definition and classification of cardiomyopathies[J]. Circulation, 1996, 93: 841-842.

2.马文珠,张寄南.心肌疾病[M].南京:江苏科学技术出版社,2000.64-69.

3.黄荣杰,刘唐威,伍伟锋等.呋喃唑酮制备大鼠扩张型心肌病模型[J].中国病理生理杂志,2003,23(10):2147-2150.

4.Klappacher G, Franzen P, Haab D, etal. Measuring extracelluar matrix turnover in the serum of patients with idiopathic or ischemic dilated cardiomyopat and impact on diagnosis andprottnosis[J].AmCardiol,1995,75:913.

5.Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease: The fibrillar collagen network[J]. JACC, 1989,13:1637-1652．

6.Mitchell GF, Lamas GA, Vaughan DE, etal. Left ventricular remodeling in the year after first anterior myocardial infarction: a quantitative analysis of contractile segment lengths and ventricular shape[J]. Jam Coll Cardiol,1992,19(6):1136-1144.                       

7.Bonnin CM, Sparrow MP, and Taylor RR. Collagen synthesis and content in right ventricular hypertrophy in the dog[J]. Am Physiol, 1981, 10: H703-H713.

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