绞股蓝抑制NAFLD兔肝脏脂质沉积量的实验研究

绞股蓝抑制NAFLD兔肝脏脂质沉积量的实验研究

刘其政   孙希杰    谭华炳   吴  凡   胡  波十堰市人民医院肝病科谭华炳

 

摘要  目的：观察绞股蓝抑制非酒精性脂肪性肝病（nonalcohol fatty liver disease, NAFLD）兔肝脏脂质沉积量作用，探讨其机理。方法：40只成年日本雄性大耳白兔随机分为NAFLD绞股蓝干预组（A组）、NAFLD辛伐他汀干预组（B组）、NAFLD模型组（C组）、对照组（E组），分别喂饲高脂饲料+绞股蓝5 g/kg、高脂饲料+辛伐他汀5 mg/kg、高脂饲料、标准饲料。实验周期9周。同步检测实验前和实验结束时血液三酰甘油（TG）、胆固醇（TCh）。制作肝组织匀浆，检测肝组织匀浆中TG含量。肝脏病理学了解NAFLD程度。结果  ⑴  TG、TCh水平：A组、B组、C组实验前后TG、TCh比较有显著差异（P<0.01）；饲养后A组、B组TG、TC低于C组，比较有显著差异（P<0.01）；A组TG低于B组，比较有显著差异（P<0.01），B组TC低于A组，比较有显著差异（P<0.01）。② 肝组织TG水平：A组、B组肝组织TG低于C组，比较有显著差异（P<0.01）；A组低于B组，比较有显著差异（P<0.01）③ 肝脏病理学：E组红润柔软，A组、B组、C组弥漫性肿大，边缘钝而厚，灰黄色，A组较B组、C组色泽红润、肿大程度轻。光镜下：E组结构和细胞形态正常，A组2/3以上细胞发生脂肪样变。B组、C组脂肪样变几乎为100%。结论：绞股蓝能够降低NAFLD兔肝脏脂质沉积量。

关键词  绞股蓝  非酒精性脂肪性肝病   脂质   沉积   预防 

The Experimental Study of Gynostemma pentaphyllum Inhibiting Lipid Deposition Weight of Rabbit Liver with Nonalcohol Fatty Liver Disease Liu Qi-zheng, Sun Xi-jie, Tan Huabing, et al. Department of Infectious Disease, Renmin Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei, 442000, China

Abstract  Objective: Observe the effect of gynostemma pentaphyllum inhibiting lipid deposition weight of rabbit liver with nonalcohol fatty liver disease, and discusses the mechanism. Methods: 40 Japanese adult male white rabbits were randomly divided into  intervention group of gynostemma pentaphyllum with NAFLD(Group A), intervention group of simvastatin with NAFLD(Group B), pattern group with NAFLD(Group C), The control group(Group E), respectively every group was given high fat and gynostemma pentaphyllum diet 5g/kg, high fat and simvastatin diet 5g/kg, high fat diet, Standard diet, the experimental cycle was 9 weeks. And synchronously tested before and after triglyceride(TG), cholesterol (TCh). Made liver tissue homogenate, detect ed the weight of triglyceride of liver tissue homogenate. Pathological changes of liver tissue were observed in order to realize the degree of non-alcohol fatty liver. Results: ⑴ TCh and TG level: Before and after the test  group A, group B and group C there was a significant difference compared with TG and TC (P<0.01), After the feeding, TG and TCh of group A and group B were lower than group C,there was a significant difference(P<0.01). The TG of group A were lower than group B, there was a significant difference (P<0.01), The TCh of group B were lower than group A,there was a significant difference(P<0.01). ⑵ The TG level of Liver tissue: The TG of group A and group B were lower than group C, there was a significant difference (P<0.01), The TG of group A were lower than group B, there was a significant difference(P<0.01). ⑷ Liver pathology: The liver of group D was Ruddy soft, the livers of group A、B、C were diffuse enlargement, edge blunt and thick, tawny, the colour and lustre of group A was ruddyer than group B and group C, the degree of enlargement lighter. With the Trypan-blue, structure and cells form of group D was normal, 2/3 above cell of group A changed with adipose kind, one hundred percent nearly cell of group Band group C changed with adipose kind. Conclusions: gynostemma pentaphyllum can reduce the lipid deposition weight of rabbit liver with non-alcohol fatty liver disease.

Keywords：Gynostemma Pentaphyllum; NAFLD; Lipid; Deposition; Prevent

 

我国成人血脂异常患病率为18.6%^[1]。高脂血症导致的非酒精性脂肪性肝病（简称脂肪肝，nonalcohol fatty liver disease, NAFLD）已经成为国人肝病的主要原因之一，防治高脂血症导致的NAFLD是当前的研究热点。课题组既往研究发现绞股蓝复方具有预防脂肪肝作用^[2]、治疗高脂血症作用^[3]。本研究试图观察绞股蓝单方对NAFLD兔肝脏脂质沉积量的影响。

1  材料和方法

1.1  一般材料  40只成年日本雄性大耳白兔，体重（2.2±0.2）kg，郧阳医学院动物实验中心提供(合格证号：0035204)。标准饲料由郧阳医学院动物实验中心提供，高脂饲料、高脂饲料＋绞股蓝饲料由郧阳医学院动物实验实验中心按照课题组配方（92.5％标准饲料＋2％胆固醇＋2％蛋黄＋3.5％猪油）配制。胆固醇购自北京双旋生物培养基制品厂（批号：20050606）。绞股蓝采自湖北省房县绞股蓝生产质量规范基地，按要求收割、凉干、储存，使用前粉碎。血脂检测试剂为瑞士罗氏公司原装进口试剂。

1.2  实验设备  全自动生化检测仪(瑞士产，Roche/HITACHE7600)。冷冻低温离心机（上海中科生物医学高科技开发有限公司，DL-45R-L）。Olympus DP-70显微摄影系统（日本奥林巴斯公司产品）。德国产组织匀浆机。

1.3  实验模型的建立  兔进入实验场地后标准饲料饲养观察1周，观察无不良反应。将40只兔随机数字法分为4组。NAFLD绞股蓝干预组（A组）：每兔每天高脂饲料100g + 绞股蓝5g/kg（根据在人体的实验剂量^[4]、有关剂量的换算方法^[5]、绞股蓝中皂甙含量^[6]计算）+ 标准饲料30～50g；NAFLD辛伐他汀干预组（B组）：每兔每天高脂饲料100 g +辛伐他汀5 mg/kg（每晚辛伐他汀先拌人少许饲料中，食完后再给予高脂饲料）+标准饲料30~50 g；NAFLD模型组（C组）：每兔每天高脂饲料100g + 标准饲料30～50g；空白对照组（E组）：标准饲料130～150g。上午9时A组、B组、C组、E组投入标准饲料30～50g；下午6时投食高脂饲料加干预药物100g（E组投入等量的标准饲料）。自由饮水，单笼喂养。

1.4  实验周期   实验周期9周，采集血液标本，肝脏CT检测后处死兔，采集肝脏标本。

1.5  血液标本采集与检测  饲养前和饲养后9周耳中动脉采集血液标本，离心后置于-20℃冰箱中保存，同步按仪器和试剂说明书检测TG、TCh。

1.6  肝组织匀浆的制备  在肝脏最大叶边缘0.5 cm处取小块肝组织，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取0.5 g置于预冷的5 mL生理盐水，迅速用内切式匀浆机4 000 r/min匀浆10 s/次，间隙30 s，连续3次，碎冰块中制成10%的肝匀浆，高速冷冻离心机4℃，3 000 r/min离心10 min，取上清3 mL密封，-20℃冷存待检。

1.7  肝脏病理学  10%的水合氯醛耳缘静脉麻醉，在肝脏在肝脏最大叶边缘0.5cm处取（1.5×1.5×1.5）cm大小肝组织1块，浸泡于10%甲醛固定液固定48h，脱水石蜡包埋，切片，HE染色，观察肝脏组织形态学改变。

1.8  肝脏CT观测脂肪肝程度  按照文献方法^[7]，实验前和实验后7周、9周对兔进行CT检查，10%的水合氯醛耳缘静脉麻醉，达到麻醉效果后将兔固定于木制动物手术台上，进行CT检查。

1.9  统计学处理  所有数据采用SPSS9.0统计学软件处理, 数据以均数±标准差表示，治疗前后组内及组间比较用t检验。

2         结果

2.1  各组动物最后标本数  实验结束A组、E组实有动物10只，B组实有动物8只（10 d、24 d各死亡1只），C组实有动物9只（15d死亡1只），统计学处理时将B组、C组死亡动物的实验前资料剔除。

2.2  肝脏CT确定饲养周期  饲养至9周时，肝脏CT提示脂肪肝模型组（C组）达到重度NAFLD，确定实验周期为9周，终止实验。

2.3  TG、TCh比较　饲养后A组、B组、C组TG、TCh与E组比较有显著差异 (P<0.01)，A组、B组低于C组 (P<0.01)。见表l。

表1  四组动物实验前后肝组织TG、血脂水平比较（ ±s）

	TG(mmol/L)			TCh(mmol/L)		肝组织TG(mmol/L)
	饲养前		饲养后	饲养前	饲养后	饲养后
Group A(n=10)	0.82±0.30		1.31±0.39①②③	1.23±0.40	36.44±6.57①②③	0.52±0.10②③
GroupB(n=8)	0.81±0.32		1.48±0.42①②	1.21±0.42	32.09±7.01①②	0.59±0.09②
Group C(n=9)	0.79±0.30		1.72±0.61	1.22±0.43	60.50±9.77	0.59±0.09②
Group E(n=10)	0.83±0.31		0.85±0.39	1.22±0.43	1.30±0.44	0.31±0.02

饲养前后组内比较 ① P＜0.01；饲养后A组、B组与C组比较 ②  P＜0.01；饲养后A组与B组比较 ③ P＜0.05

 

2.4  肝组织TG水平  A组、B组肝组织TG低于C组，比较有显著差异（P<0.01）；A组低于B组，比较有显著差异（P<0.01）。

2.5  肝脏病理学  E组红润柔软，A组、B组、C组弥漫性肿大，边缘钝而厚，灰黄色，A组较B组、C组色泽红润、肿大程度轻。光镜下：E组结构和细胞形态正常，A组2/3以上细胞发生脂肪样变。B组、C组脂肪样变几乎为100%。图1

3  讨论

减少TG在肝脏的沉积，对预防高脂血症致NAFLD具有重要意义。中医药在预防TG在肝脏的沉积上的作用得到国内外公认。中药材的产地对中药材的质量影响较大，产于湖北房县的绞股蓝为正宗^[6]。

动物实验在NAFLD防治研究中发挥着重要作用。已有研究证实，兔对外源性胆固醇吸收率高，对血液中的脂质清除率低，在实验饲料中加入适量胆固醇，一定时后就可诱发高脂血症、NAFLD、动脉粥样硬化^[8]。课题组在多个实验中建立此模型均获得成功，而且可以通过CT量化NAFLD程度，是研究NAFLD干预药物的理想模型。

实验中，通过肝脏CT检测确定饲养至9周时，模型组已经达到重度NAFLD，确定实验周期为9周。采集的血液标本显示与E组相比A组、B组、C组兔高脂血症、脂质代谢紊乱动物模型已经建立。A组、B组血脂、脂质代谢紊乱程度低于C组，说明绞股蓝具有和辛伐他汀相似的调节血脂代谢的作用。但绞股蓝降低TG作用优于辛伐他汀，辛伐他汀降低TCh作用优于绞股蓝。

他汀类调脂药通过竞争羟甲基戊二酰辅酶A(HMG－CoA)还原酶，阻断TC合成，降低血浆TC和LDL-C，包括辛伐他汀在内的他汀调脂药，其调脂和抗动脉粥样硬化（Atherosclerosis, As）作用已经得到公认。本研究提示绞股蓝调脂疗效肯定，与有关研究一致^[9-11]。

肝脏病理学检测显示，A组NAFLD程度轻于B组、C组，肝组织TG含量显示A组低于B组，说明绞股蓝具有优于辛伐他汀的抑制TG在肝脏的沉积作用。

关于以上结果，可能与以下因素有关：绞股蓝降低TG作用优于辛伐他汀，而NAFLD主要是TG在肝脏沉积；绞股蓝对血液流变学异常具有干预作用^[12]。

NAFLD发病与痰湿内侵，肝络受阻有关。绞股蓝味苦、微甘、性寒，具有清热解毒、祛出痰浊的功效^[13]，加上具有改善血液流变学异常作用，预防NAFLD兔肝脏脂质沉积具有较好作用。

现代药理研究证明绞股蓝含有83种与人参皂甙有类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂甙，皂甙具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性和药理作用^[14]。炎症因子C反应蛋白在肝脏合成，脂肪肝与CRP异常有关^[15]，绞股蓝对CRP的形成有抑制作用。

综上所述，绞股蓝通过调整血脂代谢、改善血液流变学、拮抗C反应蛋白等机制预防NAFLD兔脂质沉积，值得临床推广使用。

 

参考方献

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2         席连英, 谭华炳, 李儒贵, 等. 脂肪肝的成因与血流变的关系探讨[J]. 中国微循环杂志, 2004, 8(4): 251～252

3         谭华炳, 唐中科, 赵世印, 等. 野生绞股蓝复方治疗高脂血症临床研究[J]. 浙江中西医结合杂志, 2004, 14(7): 409～410

4         胡喜国. 绞股蓝总甙片治疗高脂血症112例疗效观察[J]. 现代中西医结合杂志, 2002, 11(4): 316～318

5         贺石林, 李元建. 医学科研方法学[M]. 北京: 人民军医出版社, 2003: 61～63

6         郑虎占, 董泽宏, 佘靖. 中药现代研究与应用[J]. 北京: 学苑出版社, 1997: 3519～3556

7         谭华炳, 贺琴. 肝脏CT值与动脉粥样硬化关系[J]. 中国比较医学杂志, 2008, 18(3): 19~22

8         范建高, 曾民德. 脂肪肝[M]. 第一版. 上海: 复旦大学出版社, 2001: 85～86

9         谭华炳, 赵世印, 赵斌. 绞股蓝的基础研究与组方应用研究概况[J]. 医学理论与实践, 2005, 18(5):  532～535

10     谭华炳, 唐中科, 赵世印, 等. 野生绞股蓝复方治疗高脂血症临床研究[J]. 浙江中西医结合杂志,  2004, 14(7): 409～410

11     陈　欣, 王　琳, 杨汉东, 等. 降纤酶、缬沙坦和舒降之对食饵性兔动脉粥样硬化影响的比较[J].郧阳医学院学报, 2004, 23(3): 138～141

12     谭华炳．绞股蓝对兔高脂血症与血液流变学影响研究[J]. 第三军医大学学报, 2007, 29(15):  1497～1499

13     谭华炳. 绞股蓝干预食饵兔动脉粥样硬化过程中对内皮素-1和C反应蛋白的影响研究[J]. 山西医药杂志, 2007, 35(10): 866～868

14     张娟, 路金才. 皂甙的提取方法及含量测定研究进展[J]. 中国现代中药杂志, 2006, 8(3): 25～28

15     谭华炳, 贺　琴. 脂肪肝与血液流变学、C反应蛋白异常的关系[J]. 中国老年学杂志, 2009, 29(7): 1662～1664