中医对卵巢TGF-β/Smad信号转导的干预及思考

摘要：转化生长因子－β(TGF-β)超家族/Smad信号转导是调控卵泡发育的重要通路, 研究中药对此通路的调节，可为阐明补肾中药作用机制提供新的理论依据和研究方向。

     中医药能促进卵泡发育成熟，改善卵巢功能和卵母细胞质量，辅助提高妊娠率，这些疗效通过长期临床实践已得到肯定，但作用机制未完全阐明。以往的研究多集中在补肾中药对卵巢相关细胞因子及受体表达的影响、对性腺轴激素及受体的调节等方面，关于这些被调节的因素最终通过什么分子机制产生生物学效应不甚明了。细胞信号转导是指细胞接受外源信号，将其转化为胞内信号，最终调节特定基因表达的过程。卵巢内的信号转导通路非常复杂，包括G蛋白介导的信号转导途径、蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号转导途径、蛋白丝/苏氨酸激酶信号转导途径等，现已证实转化生长因子－β(TGF-β)超家族/Smad信号转导通路是调控卵泡发育的重要途径。本文综合近年文献，首先总结TGF-β/Smad信号转导通路对卵泡发育的调控，然后就中药对其干预的作用作一概述及分析，希望能对阐明中药作用机制有所启发和帮助。湖南中医药大学第一附属医院妇产科尤昭玲

 

一、卵巢内的TGF-β超家族/Smad信号转导通路  

TGF-β超家族/Smad信号转导通路属于蛋白丝/苏氨酸激酶信号转导途径，由TGF-β超家族、TGF-β超家族受体和Smads蛋白家族三部分组成。

1 TGF-β超家族  转化生长因子－β(TGF-β)超家族是一组结构相关、功能多样的细胞因子家族，主要包括TGF-β、激活素（Activin）、骨形成蛋白（BMP）、生长分化因子（GDF）等，它们参与调节哺乳动物的多种生理活动，在卵泡的发育中也起着重要作用。

1.1转化生长因子－β(TGF-β)

多种组织细胞可合成TGF-β，以自分泌或旁分泌方式调节细胞的生长和分化。目前发现至少有5个亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5，各亚型在许多生物反应中表现出相似的作用。其中TGF-β1所占比例最高（>90％），活性最强，是一种多功能的细胞活性调节因子，在胚胎发生、脂肪形成、肌肉形成、软骨形成、骨发生、上皮细胞分化、纤维发生以及免疫细胞的功能调节方面发挥重要作用。

1.2 激活素（Activin）  

激活素(activin)、抑制素(inhibin)、卵泡抑素(follistatin)均为TGF-β超家族成员，主要由垂体和卵巢颗粒细胞分泌。抑制素有抑制素A(INHA)及抑制素B(INHB)2种化学结构相似的亚型，两者均可选择性反馈抑制垂体垂体促卵泡素（FSH）的合成和分泌，在卵泡募集和优势卵泡的选择中起作用。激活素有激活素A(ACTA)、激活素B(ACTB)和激活素AB(ACTAB)3种亚型，为抑制素的同源或异源二聚体，其作用与抑制素相反，可以促进垂体FSH分泌，调节颗粒细胞的分化，激活素A还有促进卵泡发育的作用。卵泡抑素(FS)是激活素的结合蛋白，通过与激活素的不可逆结合间接抑制FSH的合成与分泌，对抗激活素对卵泡的作用。目前认为ACT-INH-FS作为一个系统，通过内分泌途径对垂体FSH的合成和分泌进行反馈调节，并在卵巢局部通过自分泌或旁分泌的途径，调节卵泡膜细胞和颗粒细胞对促性腺激素的反应性，故此系统与卵泡的发育密切相关，是参与卵泡发育的主要的卵巢内部因子 ^[6－9]。

1.3 抗苗勒激素(AMH)  

AMH是TGF-β超家族成员之一，参与卵泡的发育过程。AMH在始基卵泡中无表达，在窦前卵泡和小窦卵泡（直径≤4mm）的颗粒细胞中高表达，在4～8mm卵泡中表达量逐渐下降，而在8mm以上的窦卵泡中AMH表达消失，在闭锁卵泡中亦无表达。目前发现AMH主要通过抑制始基卵泡发育的起始及抑制卵泡对FSH的敏感性这两方面来抑制卵泡发育，并且发现AMH是预测卵巢储备功能和卵巢反应性的良好指标之一^[10-11]。

1.4 骨形成蛋白（BMP）

目前的研究已发现BMP有10多种亚型，由不同的细胞在卵泡发育的不同阶段分泌，比如BMP-15是卵母细胞来源的因子，动物实验研究证明其能调控周围颗粒细胞的分裂，对正常卵母细胞发育及生殖功能具有重要的影响。BMP-6可由卵母细胞和颗粒细胞分泌，目前认为可能与优势卵泡形成后的卵泡闭锁相关。颗粒细胞还能分泌BMP- 2和BMP- 3，有研究显示BMP- 2重组体可以增强绵羊颗粒细胞中的FSH 引导的雌激素（E₂）和抑制素A 的产生, 刺激抑制素B亚组mRNA的表达以及体外培养的人类粒层黄体细胞中抑制素B蛋白的产生。BMP-3在卵巢中的生化作用还不清楚。已有发现大鼠的卵泡膜细胞可以产生BMP- 3b、BMP- 4和BMP- 7，其中BMP- 4和- 7的重组体可以通过促进FSH 诱导的E₂ 的生成和抑制孕酮的生物合成来调控FSH 的信号传导。

1.5生长分化因子（GDF）

GDF-9 和GDF-9B主要在人类和其它哺乳动物的卵巢表达，GDF-9是卵泡正常生长发育必需的细胞因子，它通过自分泌方式促进卵母细胞进行有丝分裂，通过旁分泌的方式调节颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖分化，同时影响卵巢内类固醇激素、蛋白酶及其它细胞因子的分泌。GDF- 9B可能通过和GDF- 9共同作用来调节颗粒细胞的功能, 比如促性腺激素诱导的增生和分化。

2 TGF－β超家族受体  TGF－β超家族受体通过与配体（TGF-β超家族）的结合及活化，启动Smad信号转导通路。目前共发现8种受体，即受体Ⅰ（TβRⅠ），受体Ⅱ（TβRⅡ），受体Ⅲ（TβRⅢ），受体Ⅳ（GH3），Endoglin，PLBPs（含有可结合TGF-β1和TGF-β2的两种受体），GI-210。其中研究得比较清楚的为TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ，这3种受体具有较高的同源性，且TβRⅠ和TβRⅡ 均为具有丝氨酸／苏氨酸激酶活性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分为细胞外配体结合区、跨膜区和胞内丝－苏氨酸蛋白激酶区。

2.1 TβRⅠ

又称为活化素样蛋白激酶(Alks) ，可分为Alk5、Alk3和Alk1三个亚群。Alk5亚群包括TGF-βⅠ型受体Alk5、激活素受体Alk4和Nodal受体Alk7；Alk3亚群包括BMPⅠ型受体Alk3和Alk6；Alk1亚群包括同BMP /GDF和TGF-β/Activin作用的Alk1和Alk2。TβRⅠ的C端含有一个保守的Gs结构域（Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly），是接受TβRⅡ磷酸化激活的部位，具有传递信号的作用。

2.2 TβRⅡ

包括TGF-βRⅡ, Activin RⅡ, Activin RⅡB，BMP /GDFⅡ型受体(BMP RⅡ)，AMH的Ⅱ型受体(M IS RⅡ)。

2.3 TβRⅢ

亦称为β烯糖，无信号转导结构，但可提高配体对TβRⅡ的亲和力。

3  Smads蛋白家族  是目前已被证实和公认的TGF-β超家族受体作用的底物，能将从TGF-β获得的信息传递到细胞核内。Smads家族的蛋白结构具有高度的同源性，一级结构由三部分组成：高度保守的氨基端即MH1区、高度保守的羧基端即MH2区以及富含脯氨酸的连接区。在介导TGF-β超家族信号时，MH1区发挥与DNA结合的作用，MH2结构域可调节靶基因的转录。

根据Smads蛋白在信号转导中的不同作用可将其分为3类：①受体激活型Smads（receptor-activated Smads）或途径限制型（pathway-restricted Smad）：即R- Smads，包括Smad 1、2、3、5、8、9、10。其中Smad 1、5、8、9 参与BMP的信号转导，Smad2、3 参与TGF-β和Activin的信号转导，而Smad10主要参与激活BMP 拮抗剂（神经诱导及发育的关键因子）与成纤维细胞生长因子（FGF）的活性。②共同介质型或通用型Smads：即co-Smads，包括Smad4，有1个富含脯氨酸的Smad4 活化区，是激活依赖Smad蛋白的转录反应所必需的。Smad4可以与所有已活化的R- Smads结合，是BMP 、TGF-β和Activin信号转导途径的共同通路。③抑制型Smads：即I-Smads，包括Smad6、7，可拮抗R-Smads介导的信号传导，形成控制TGF-β超家族作用的负反馈环路。

4        卵巢内TGF-β超家族信号的转导

nTGF-β超家族成员（配体）在细胞外先与TβRⅢ形成复合物，再被传递给处于自动磷酸化的TβRⅡ，或配体直接与TβRⅡ结合形成二元复合物，随后磷酸化激活TβRⅠ，形成三元/二元复合物，使TβRⅠ在靶细胞内与膜受体偶联的GS 区活化，并与之形成信号复合物，随后激活R- Smads蛋白MH2区的受体磷酸化位点（SSXS 基序）。活化的R- Smads与co-Smads即Smad4形成异多聚体， 然后进入细胞核中，通过Smad4和Smad3 的MH1区与DNA上的Smad 结合元件松散结合，在局部一些转录共激活因子和／或共抑制因子的影响下，MH2区的转录激活序列与靶基因形成紧密结合，最终实现信号转导。I-Smads不能被受体磷酸化，但可竞争性地与活化的TβRⅠ牢固结合，阻止R- Smads的磷酸化，从而负反馈控制TGF-β信号的强度和持续时间。

4.1 Smad2/ Smad3介导的通路  

已证实TGF-β、Activin、GDF-9可通过细胞内Smad2/ Smad3的介导完成信号传递。

4.1.1  GDF-9来源于卵母细胞和颗粒细胞，通过自分泌和旁分泌方式作用于靶细胞（卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞）的BMP RⅡ，再激活受体Alk5，随后激活靶细胞内Smad2/ Smad3，活化的Smad2/ Smad3与Smad4形成多聚体，进入核内调控靶基因的转录。目前已发现GDF- 9可以引起颗粒细胞的透明质酸合成酶2(Has2)、环氧化酶2(Cox2) 和类固醇生产的敏感调节蛋白(StAR) mRNA的表达, 而抑制尿激酶型纤溶酶原激活物( uPa)和黄体化激素受体(LHR)的表达。

4.1.2  ACT、INH、FS来源于卵巢颗粒细胞，在卵巢内部通过自分泌和旁分泌方式作用于颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵母细胞，其中ACT作用于靶细胞的activin RⅡ，再激活受体Alk4，随后激活靶细胞内Smad2/ Smad3，并与Smad4形成多聚体，进入核内调控靶基因的转录。目前发现ACT可调节颗粒细胞的分化, 并且和卵泡的发育阶段相关。体外培养未分化的大鼠颗粒细胞发现ACT可促进其表达芳香化酶、促卵泡素( FSH )和黄体生成素( LH ) 受体, 刺激雌二醇( E2 ) 和孕酮( P)的分泌, 并且上述作用不依赖于FSH, 但可被FSH 增强。同时, ACT促进颗粒细胞INH的基础分泌和FSH 诱导的分泌及其INH亚单位的表达。INH、FS的信号通路暂未明确。

4.1.3 TGF-β由卵母细胞和卵泡膜细胞产生，作用于颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵母细胞的TGF-βRⅡ，再激活受体Alk5，接下来的细胞内信号途径同GDF-9。

4.2 Smad1/ Smad5/ Smad8介导的通路 

已证实BMP、AMH可通过细胞内Smad1/ Smad5/ Smad8的介导完成信号传递。

4.2.1 BMP 卵母细胞分泌BMP-15和BMP-6，颗粒细胞分泌BMP-2、BMP-3 BMP-6、BMP-7，卵泡膜细胞分泌BMP-3、BMP-4、BMP-7，这些亚型均可通过旁／自分泌作用于靶细胞的BMP RⅡ，然后激活受体Alk2，Alk3和Alk6，活化的受体再磷酸化激活细胞内Smad1/ Smad5/ Smad8，后者与Smad4形成多聚体，进入核内调控靶基因的转录。不同亚型引起的生物学效应见前述（1.4）。

4.2.2 AMH由卵巢颗粒细胞表达，作用于颗粒细胞和卵泡膜细胞的M IS RⅡ，然后激活受体Alk2，Alk3和Alk6，接下来的信号转导途径同BMP。

 

二、中医药对卵巢内TGF-β/Smad信号转导的干预及思考

细胞信号转导是非常复杂的过程，涉及胞外配体、跨膜受体、胞内各种信使分子等，机体某种生理和病理现象的产生往往涉及众多的信号转导通路，且多条通路错综复杂，譬如卵泡的发育，是众多细胞因子和激素（胞外配体）通过多条信号转导通路来调控的，很多过程还未弄清楚。所以选取一条研究得比较成熟、已得到公认的转导通路很关键，TGF-β超家族/Smad信号转导就是目前已被证实的、和卵泡发育密切相关的通路。以往文献报道的大部分研究集中在中医药对卵巢内TGF-β超家族（配体）的调节，如对ACT-INH-FS、AMH、BMP、TGF-β1等的调节，对受体和胞内信号分子的研究较少，对细胞内Smads蛋白的干预研究更是凤毛麟角，如孙丽萍等^[18]报道四物合剂通过升高小鼠卵巢颗粒细胞P-Smad2/3的表达以维持芳香化酶表达水平的正常，维持卵巢的正常分泌功能，对卵巢形态和颗粒细胞增殖亦有保护性作用，对于临床防治化疗性卵巢早衰具有一定的可行性。崔瑞琴等^[19]报道菟丝子黄精颗粒剂可干预和修复雷公藤多苷所致雌鼠卵巢损伤，其机制是菟丝子、黄精可以促进被雷公藤多苷所抑制的卵巢组织中Smad4 mRNA的表达。虽然中医药干预卵巢细胞内Smads蛋白的文献很少，但已发现较多中医药干预骨质疏松症骨组织和下丘脑等部位TGF-β/Smad转导通路的研究，这些研究为中药对卵巢内TGF-β/Smad信号转导的干预揭开冰山一角，启发我们从新的角度阐明中医药干预卵泡发育的机制。

 

        2009届在读博士生：申可佳整理