精子的冷冻保存

    一、方法评估的复杂性和方法选择的矛盾性

    由于存在很多变异因素，致使难以对不同冷冻保存方法进行有效和科学的比较。

应用冷冻保护剂的预处理条件（温度、时间、浓度和附加方法），冷冻保护剂的特性（单独使用或加人增效剂中），冷冻增效剂的特性和成分，例如缓冲化的两性离子月任5－TRIS柠檬酸蛋黄（TESTCY），磷酸蛋黄柠檬酸（EYC），化学成分明确的（修改的）Tyrode人类精子保存基质（HSPM）和化学成分不明确的（加人蛋黄者）HSPM等均会影响结果。再者，下述因素作为预处理条件可能是导致冷冻保存的结果产生差异的基础：冷冻和解冻条件（速率恒定或可变，操作步骤编程或未编程的），以及包装类型（吸管、安瓶或小瓶）和冷冻位置（水平、垂直或成角放置）等。因此，必须通过考察和评价冷冻杭州市红十字会医院生殖医学科孙中明

保存过程中每一步骤的各种因素之间相互关系，才能对一种特定的冷冻保存方法的结果作出有根据的科学比较。看来尚无一种最佳的首选方法，能成功地用于精子冷冻保存。这种比较研究观察到并证明不论在实验室检测或临床操作中均可存在各种条件因素之间的相互作用。因此世界各国的精子库，其精子冷冻保存的方法不尽相同，亦不是一成不变。它们均对早期的经典方法作了不同程度修改。这些修改均是

根据各自实践经验、数据或操作步骤和条件而设计的。而这些步骤和条件也因地制宜在人类精子和牛精子的冷冻保存方法中全部或部分地采用。

    因此迄今已有大量的条件和技术可成功地用于人类精子的冷冻保存，且可适用于精子库。尽管如此，只有那些经临床证实能产生正常子代的技术才可应用于建立精子库。活动精子具有极好的冷冻生存力，尽管其本身是一个理想的条件，但临床应用冷冻库精子时以此作为选择冷冻方法的惟一根据是不够的。

    二、液氮气雾冷冻法

    大约在35年前，由Shemian提供的一种基本的、相对简单的液氮气雾冷冻技术，已在多年来人类精子冷冻中被证明是成功的、它可与电脑控制的新型高级冷冻系统相媲美，后者结构复杂而价格昂贵。大多数大型的著名精子库都采用基本的液氮气雾冷冻法。当用于大量不同样品或冷冻保存中复杂的预处理及冷冻保护技术时，各种冷冻速度（1一15`C/min)和解冻速度（I一60"C/min)，均能导致满意的精子生存及成功的临床应用。

    各种改良方法能成功用于气雾冷冻。贮存于吸管、安瓶或冷冻管中的精子。带雪茄形管子的金属容器（如茶罐），放有吸管的其他支架，或放有安瓶或冷冻管的架子，都可直接放人液氮冷藏器中的液氮气雾中，这种冷藏器需有足够体积，以便在液氮中存放装有冷冻精子的容器，同样也要求能在液氮表面的气雾中冷冻精子，生物液氮干燥运输器亦能用来气雾冷冻精子，然后转移到另一个冷藏器中储存。

    三、冷冻保存的一般步骤

    （一）精子的收集

    禁欲期（通常为3一5d),Fm}，用手淫方法将精子收集于10～20mL无菌的聚丙烯样品收集容器中。要求禁欲期是为了更好地冷冻保存样品。通常而言，这样的精子与收集前禁欲期较短及不规则的精子相比，冷冻保存后的特性更恒定且更完善。射出的精液是液态的，但正常情况下立即凝结成胶状。凝结后的精液通常在30min内液化，此时就可测定其体积。为了使精子获得最大的冷冻存活力，应在收集

精液后I min内开始对液化精子进行冷冻保存处理。

    （二）体积的测量

    体积可用较准的加样器或带针头的5mL注射器来测量，有时也可根据收集精液前后采样瓶的重量之差来计算。取0．卜0 ．2mL精液作精液分析（活动精子的百分数及其质量、精子密度等），此外尚需取出一些精液，同时以用来做筛选某种性传染疾病的检测、进行某些检测以筛选导致性病的微生物如奈瑟淋球菌等（详见有关章节）。

    （三）甘油化

甘油作为冷冻保护剂，可以分步方式直接加人到未经处理的精液之中。每次加人后混匀，时间间隔为1 min；或间接地作为扩张液或基液的组分，经稀释后逐步加人精液。而在美国与加拿大，40%以上的著名精子库，仍单独使用甘油作为冷冻保护剂，而越来越多的新的精子库则使用扩张剂，尤其是含甘油的两性离子缓冲系统。甘油化的条件不一定涉及温度的特殊条件（除了室温之外）和接触时间（除了加入甘油及混匀所需时间之外）。

    （四）包装和存活力观察

    甘油化的精液可吸入塑料吸管（可用封口剂，加热，或用尼龙塞来密封）或放人玻璃安瓶（用火焰封口），也可放人塑料冷冻管（冷冻小瓶）后用螺口盖拧紧。每份冷冻精液的体积通常是0.4一0.8mL，这可作为人工授精的一个单位。当然如果合适，人工授精也可能使用一个单位以上的精液，选择用于冷冻保存精子的容器是很重要的。这种容器应是易于标记、操作、储存，同样也应具有很好的生物兼容性以及抗压性能。高质量的聚丙烯吸管或小瓶看来最符合这些标准，而没有易碎及被洗涤剂污染等玻璃容器所具有的缺点。放人液氮冷冻之前，除了要对被冷冻和储备的精子进行分装以外，还需准备一份

质量控制检测样品。对收集后未经处理的精液、用冷冻保护剂处理过的精液以及储存前、冻融后的精液均应观察其中的活动精子及其活动力。通过观察能追踪冷冻保存各阶段的精子生存情况，并能确保了解冷冻精子的存活能力。

    （五）冷冻

    吸管、安瓶中的精液冷冻保存时可分散或成组贮存，其位置保持垂直、水平或倾斜。通常是放在液氮气雾中，有时也可放在机械（电子）冷冻柜的冷冻气中。冷却和冷冻过程则可用人工以静态或逐步方式，也可用电脑控制的液氮供给系统来完成。最常用的是操作者利用液氮储存容器中的气相以直接一次性或逐渐方式进行冷冻。带有吸附液氮的石棉衬垫的生物干燥运送器，也能在气相中用于冷冻，然后在液相中转移到储存容器。

    （六）储存

    经分装的样品，均应贮存在金属容器内的液氮之中，而这些容器则应放置在适当的液氮冷冻箱之内。用以监视液氮水平面的装置［机械的和（或）电子的〕是为了长期储存在高于液氮温度（一1％℃）的情况下防止丧失精子功能，监视水平面的常见机械（手工）方法是将一根带刻度的插杆垂直放人液氮底部后拔出，则在其上面就会形成

一条霜线，以指示液氮水平面，至于各种复杂的局部和遥控电子警报系统现许多国家均已有市售。另一方面，少数精子库只使用闪烁灯定期用肉眼检查，AATB的组织库标准只要求一个有效的监测程序，以确保样品始终储存在液氮表面之下。冷冻生物学家和有关研究人员，通过融解储存前样品，并进行检测，发现在冷冻刚开始期间精子活动力有某些丢失。然而以后储存在液氮表面之下一1％℃的冷冻精子，活动力没有进一步丢失，人们已经证实癌症患者治疗前精液中的精子冷冻生存活动力往往是差的（解冻后精子活动力百分数降低），尽管如此，这降低了的运动能力在长期储存期间并不进一步降低。

    在所调查的42家AATB成员的组织库中，只有2家报道了精液〔由正常供精者及（或）治疗前患者提供」长期保存期间精子活动力丧失的例子。另有报道只有1例冷冻保存3年后精子活动力丧失。可以为人们所接受的观点是，贮存过程中精子活动力丧失系冷冻前没有准确测定所致或更可能是由于没有确保最佳储存条件所造成的。

    （七）解冻

    将装有冷冻精子的包装盒暴露于空气或水中即可使冷冻精液恢复液态。通常暴露在室温，但也可暴露在其他温度下，这要根据各精子库设计的方法学而定。

    （八）分发

    若临床医师需要冷冻精子以开展NF一ET，精子库应按要求送到该医师所在医院（或）诊所。冷冻精子从精子库的贮存柜取出后应放在预先盛有液氮或固体二氧化碳（干冰）的特殊运送盒内。然而，精子库若就在医院内，且离操作室甚近，则可不必放在上述特殊运送盒内，而可直接送到操作室供医师使用。冷冻精子在送临床使用前的融化有助于通过质量控制，再次评估精子冷冻存活状态。

    四、冷冻保存的特殊步骤（Shennan法）

    除非特别说明，所有步骤或处理均在室温（22`C左右）中进行。

    （一）精液的收集

禁欲3一5d后，通过手淫射出的精液被收集在容积为80一100mL的无菌聚丙烯塑料容器中。然后在90min内按冷冻保存的要求进行处理，同时观察与测量必要的参数。若符合标准，就全部用于冷冻保存。

（二）精液体积的测量

    当凝集的精液液化时，就可用带针头的5mL注射器吸人精液以测定其体积，然后再注回容器中作甘油化处理。此时可取出少量精液（约0.2mL）作精液分析（观察活动精子的百分数，类型和持续时间、活力染色，精子密度及异常精子）、检查性病（包括艾滋病）的病原体和（或）抗血清，必要时应作精液培养。根据医师相对工作量和时

间安排的习惯，可以从为确定冷冻生存（活动能力）而解冻的质量控制管中取出精液，作精子密度和异常精子的观察和测量以及培养。这也能在冷冻程序结束后选择方便的时间进行，只要吸管在液氮内即可。然而，存活力染色测量应在冷冻前和解冻后的样品中进行。活动力的观察也应同时进行。

    （三）甘油化

    将精液置于混旋器上混旋，同时逐渐把甘油滴人其中，每2滴之间相隔1 min。每毫升精液中加人3滴甘油，则甘油浓度约为12%一15%，没必要精确定量，因为在这一浓度范围内，精液冷冻保存的效果是一样的。然而有的实验室结果表明甘油浓度在5%一10%a范围内，冷冻保存效果没有差别。

    （四）分装

    每份精液冷冻前可用若干容积为0 ．6mL的聚丙烯塑料管来分装，用记号笔作上相应的标记，如精液提供者、患者或精液存放者的编号及日期。分装准备工作也能在测量精液体积后或在收集精液之前进行。根据正常供精者或精液寄存者精液体积的平均值来确定所需吸管的数目。除精液贮存管外，还要准备一根体积小一些（约0.3mL)的质控测试吸管，用以在贮存之前吸取少量精液作为检测冷冻存活百分数的质控样品。为确定精子功能丧失的程度和时间，并测定其冷冻存活率，对于收集后尚未处理的新鲜精液、冷冻保护剂处理后的精液及冻一融后的精液均需观察精子活动率及其质量。可使用容积为2一3mL塑料注射器带有一内径为3min左右的接口，将精液吸人后再注人到塑料吸管。甘油化的精液被定量加人吸管，开口端用吸水纸擦干以备封口，先用硬尼龙塞子塞人海根吸管的开口端，然后放在桌上压紧，并在吸管上端向下垂直加压以完全封口；重复上述步骤封住从注射器上拔下的另一端。因为一端已经封住，这样就可在封吸管另一端时避免精液丢失、在装入经冷冻保护剂处理后的精液时，吸管内应留下足够的空间，以便用塞子封口，且可避免冷冻过程中因冰的膨胀而

将密封塞顶掉，也可避免解冻时精液的丢失或污染。用以加样的标本管应在使用前作记号（线或点），这样就能指示加样的最大容量，并可为塞子及冷冻膨胀留出足够空间。尼龙塞封口可简便地适应一部分精液包装，如待测样品的准备、质控和筛选，在加样、封口、冷冻、贮存或解冻过程中，这种简便而有效的分装方法很少会出现什么间

题，利用这种塑料管贮存精液还便于最有效地节省贮存空间。

    （五）冷莎

    装有已甘油化精液样品并已标记和封口的吸管，就可插人金属架的铝套内。这些套管要有与插人其中的吸管一一对应的标记，以便以后找寻样品。套管底部打一个孔，便于贮存时让液氮进人以浸泡密封的吸管。

    冷冻的方法一般有两种：一是在机械（电子）低温冰箱约一83℃的冷气中冷冻；二是在液氮罐内液氮水平面上的气雾中冷冻。两者都应持续30一60min的冷冻时间。有人将同一个样品分成两部分进行研究，显示两种方法对于情子冷冻存括无区别。但液氮法更简单，更便宜而且所需的设备是可携带的，可以在实验室外的门诊甚至远

离实验室的地方进行冷冻。可以使用各种大小的液氮贮存器，只要冷冻时样品悬挂在气雾中，不管有没有特别的冷冻小罐。许多实验室都使用改进的液氮气雾冷冻法，但主要原理是一样的。精液不论是放在管子或其他容器中部应悬挂在液氮气雾之中。各种容器无论放置在金属架、盘子、套管或罐内，无论垂直、水平或倾斜放置，均能成功地冷冻贮存。

    （六）储存

    将已经冷冻好的装有样品的吸管很快地用预冷的镊子放人已有适当标记的雪茄状铝质套管中，迅速把它盖紧后置于预冷的标记铝罐中，然后很快转人液氮中的贮存罐内，放在低温冰箱内便于迅速找寻的位置。对用另一种方法冷冻的铝套管内的样品管也可以同样方式贮存。标记必须清楚且有助于准确地鉴别出贮存的精液样品，以便在使用的目录系统中很快能找到。

    （七）解冻

    将样品管于室温下浸在自来水或双蒸水中或仅仅暴露于空气之中（两者均在室温下22℃左右进行），就能使冷冻于样品管内的精液解冻。用同一样品进行比较研究显示两种解冻方法对精子冷冻存活并无差异。