凉血解毒汤治疗急性再生障碍性贫血的机制探讨

         凉血解毒汤治疗急性再生障碍性贫血的机制探讨

内容摘要  目的：探讨凉血解毒汤治疗急性再生障碍性贫血的机制。方法：采用酶联免疫法检测急性再生障碍性贫血患者及正常对照骨髓上清液中TNF-α、IFN-γ、sIL-2R的含量，并观察凉血解毒汤在体外对骨髓单个核细胞经PHA诱生的造血负调控因子的调变作用。结果：急性再生障碍性贫血患者骨髓上清液中TNF-α、IFN-γ、SIL-2R的含量明显高于正常对照（P值分别为0.03，0.016，0.048）；体外试验表明，在多数急性再生障碍性贫血患者中凉血解毒汤可明显抑制IFN-γ、sIL-2R的分泌（P分别为0.038，0.001）,而对TNF-α无明显影响（P>0.05）。结论：急性再生障碍性贫血的发病机制与造血负调控因子的异常增高有关；凉血解毒汤在凉血止血、清热解毒的同时，也可能通过下调IFN-γ，sIL-2R的含量而促进造血功能恢复，起到治疗急性再生障碍性贫血的作用。廊坊市中医院血液科王茂生

关键词：再生障碍性贫血，急性；TNF-α，IFN-γ，sIL-2R；凉血解毒汤

Mechanism investigation on treatment of acute aplastic anemia patients by Liang-Xue-Jie-Du decoction

YANG Shu-lian,ZHANG wen-yi,WANG dong-xia et al.

Institute of Hematology of Lang Fang,Hebei,065000

Objective:To study the treatment mechanism of Liang-Xue-Jie-Du decoction in acute aplastic anemia(AAA). Methods:To determine the levels of tumor necrosis factor alpha(TNF-α),Interferon gamma(IFN-γ) and  Solube interleukin-2 receptor(sIL-2R) in bone marrow(BM) of AAA.and  to explore the effect of Liang-Xue-Jie-Du decoction to TNF-α,IFN-γ, sIL-2R in vitro.Results:Comparing with the normal controls, TNF-α,IFN-γ, sIL-2R of patients with AAA in BM had higher levels(p 0.03，0.016，0.048,respectively).In the most AAA patients,the levels of

                   

¹河北省科技攻关课题NO99276221D

IFN-γ，sIL-2R were reduced by Liang-Xue-Jie-Du decoction in vitro,however no significant chang in TNF-α.Conclusion:The occurrence  of AAA is relased with relased a lot of hemopoietic negative regulating factors. Liang-Xue-Jie-Du decoction might to promote the recovery of hemopoietic function through reducing sIL-2R and IFN-γlevels.

Key words: aplastic anemia, acute; TNF-α，IFN-γ，sIL-2R; Liang-Xue-Jie-Du decoction

急性再生障碍性贫血（简称急再）是一组多因素引起的异质性较强的综合症，以发病急、进展快、骨髓造血衰竭、全血细胞减少、出血和严重感染为特征。临床上治疗效果不甚理想。我院中医血液学专家根据中医辨证自拟凉血解毒汤配合西药治疗急再，经30多年的临床实践取得了很好的疗效^[1-2]。为进一步探讨凉血解毒汤的治疗机制，结合急再发病的免疫机制，我们观察了体外凉血解毒汤对造血负调控因子的调变作用并进行了初步分析。

材料与方法

1          病例选择：1999年1月?2004年11月，在我院治疗的17例初诊急再患者。其中男11例，女6例。年龄7岁?49岁，中位数年龄27岁。17例均经临床及实验室确诊，诊断符合全国统一标准^【3】。

2          正常对照：为9例健康志愿者。多数为患者亲属。男7例，女2例。年龄29岁?48岁。中位数年龄40岁。

3          试验材料：TNF-α，IFN-γ，sIL-2R，ELISA试剂盒购自Immunotech公司。1640培养液为GIBO公司产品。胎牛血清为医科院血研所产品。PHA为广州市医药研究所产品。凉血解毒汤为本院制剂室协助制备。方药组成：羚羊角粉，琥珀粉，生地，丹皮，玄参，麦冬，贯众，银花，连翘，板蓝根，栀子，三七粉。经水煎浓缩（个别药不经水煎，经特殊处理），最后浓度为1g生药/ml，无菌分装保存。

4          标本采集：无菌取患者及正常对照骨髓液5ml，肝素抗凝，先离心取上清液1ml,-20℃保存备用，用于检测骨髓液中TNF-α,IFN-γ，sIL-2R含量。然后用淋巴细胞分层液分离骨髓单个核细胞（BMMNC），用PBS缓冲液洗两遍，配成细胞悬液备用。

5          细胞培养上清液的制备：17例患者中，有10例做了细胞培养上清液的制备。细胞培养分三个体系，分别为中药组：中药（5mg/ml）＋BMMNC（2×10⁵）；PHA组：PHA（100μg/ml）＋BMMNC（2×10⁵）；中药PHA组：中药（5mg/ml）＋PHA（100μg/ml）＋BMMNC（2×10⁵）；三组培养体系均用含20％胎牛血清的1640培养液做培养基，总体系2ml。在37℃，5%CO₂和100%湿度的CO₂培养箱中培养72小时后，离心取上清液1ml，-20℃保存备用，用于检测培养液中TNF-α，IFN-γ，sIL-2R含量。

6          TNF-α，IFN-γ，sIL-2R检测：采用ELISA法，严格按照说明书操作。用自劝酶标分析仪测定。

7          统计学处理：数据以均数±标准差表示。骨髓上清液各组数据间的比较采用独立样本t检验；细胞培养上清液各组数据间的比较采用配对t检验。

结  果

1 骨髓上清液中三种细胞因子的含量详见表1。结果显示骨髓上清液中，急再患者的造血负调控因子TNF-α，IFN-γ，sIL-2R的含量明显高于正常对照（P值分别为0.03，0.016，0.048）。表明急再患者存在严重的免疫异常。

表1骨髓液上清中细胞因子的含量

组别         TNF-α       IFN-γ         sIL-2R

                  pg/ml        IU/ml          μg/ml

正常对照组     30.49±12.99   0.72±0.45     2.65±0.56

急再患者组     41.28±10.35   1.49±0.68     3.18±0.89

2 培养细胞上清液中三种细胞因子的含量详见表2。结果显示各组之间TNF-α均无明显改变（P>0.05）。在PHA组中IFN-γ，sIL-2R明显高于中药组（P分别为0.025，0.02）。而中药PHA组，10例检测标本中有8例IFN-γ明显低于相应的PHA组（P＝0.038），另2例无明显改变（P>0.05）；有7例sIL-2R明显低于相应的PHA组（P＝0.001），其余3例无明显改变（P>0.05）。提示中药在体外可以抑制或中和多数急再患者的部分造血负调控因子（IFN-γ，sIL-2R）。

表2中药对细胞因子的影响

组别         TNF-α       IFN-γ         sIL-2R

                  pg/ml        IU/ml          μg/ml

中药组         11.12±1.01    0.77±0.12      1.22±0.14

PHA 组        13.71±3.31    2.11±1.36      1.65±0.17

中药＋PHA 组  16.36±1.39    1.01±0.26      1.35±0.17

讨  论

急再的发病机制主要与免疫异常有关，多数由于细胞毒性T淋巴细胞的异常活化，产生大量的造血负调控因子（主要是TNF-α，IFN-γ，sIL-2R），抑制造血干/祖细胞并诱导其调亡^【4?6】。我们检测了17例急再骨髓中TNF-α，IFN-γ，sIL-2R含量，结果明显高于正常对照，与国内外报道基本一致，支持急再的发病机制与免疫有关的论点。急性再障初期往往表现为反复高热、严重出血，贫血症状明显，并呈进行性加重，中医认为均由温热毒邪耗精伤髓所致，温热毒邪不去，正气断难恢复，故以凉血止血以减轻出血症状，清热解毒以解除毒邪之扰，方用凉血解毒汤。我院采用凉血解毒汤配合西药治疗急再已有30多年的历史，并且疗效显著^【1?2】。以往我们对患者治疗前后骨髓上清液中TNF-α，IFN-γ，sIL-2R对比研究发现，治疗效果与下调TNF-α，IFN-γ，sIL-2R含量明显相关，疗效好的患者治疗后TNF-α，IFN-γ，sIL-2R下降明显，疗效不好的患者治疗前后TNF-α，IFN-γ，sIL-2R无明显改变。由于治疗是综合的，既有中药也有西药，这种检测不能说明中药的直接作用。因此我们进一步观察了凉血解毒汤在体外直接对BMMNC（主要为淋巴细胞）的作用。发现凉血解毒汤在多数患者中可以抑制IFN-γ，sIL-2R的分泌，即凉血解毒汤在凉血、止血、清热、解毒的同时还可以部分通过下调造血负调控因子来起到治疗急再的作用。由于中药组方复杂、作用机制复杂，我们的结论只是初步的，对造血负调控因子的确切调变机制尚需进一步研究。

参考文献

1          梁冰.治疗再生障碍性贫血的思路.中医杂志,1995,12:749?751。

2          杨淑莲，梁冰.中药并雄激素治疗急性再生障碍性贫血45例临床分析.实用中西结合杂志，1994，11:650?651。

3          张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准。第二版。北京：科学出版社，1998.

4          Young NS.Autoimmunity and  treatment in aplastic anemia.Ann Intern Med,1996,124(2):166-169.

5          Killick SB,Cox CV,Marsh JC,et al.Mechanisms of bone marrom progenitor cell apoptosis in aplastic anemia and the effect of anti-thymocyte globulin :examination of the role of the Fas-Fas-L interaction.Br J Haematol,2000,111:1164-1169.

和虹，邵宗鸿，何广胜，等.Th1细胞在再