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- 流式细胞术检测儿童急性白血病血小板活化功能的研究
- 作者:王茂生|发布时间:2010-10-18|浏览量:2702次
提要 建立微量全血血小板活化功能流式细胞术(FCM)检测方法,探讨儿童急性白血病(AL)不同阶段血小板活化状态及活化功能的变化。利用FCM检测微量全血中血小板活化特异性单克隆抗体CD62p、PAC-1在AL初论未治(21例)、诱导缓解后(CRI、14例)、及持续完全缓解(CCR)2年以上(6例)患儿血小板表面表达百分比和ADP激活后表达变化,并以16例外科畸形择期手术前患儿作为对照。结果,AL初诊未治和CRI时ADP激活前后血小板CD 62p表达均高于对照组(P< 0.05),AL初诊未治ADP激活后血小板PAC-1表达低于对照组(P<0.05),CCR 2年以上者ADP激活后血小板CD62p表达高于对照组(P<0.05)。结果表明:AL初诊未治时体内血小板活化增强,ADP激活后血小板活化功能降低;AL缓解后ADP激后ADP激活后血小板活化功能恢复,但体内血小板活化状态仍高于对照组,CCR 2年以上者ADP激活血小板活化功能增强。提示血小板功能异常在AL初诊未治时出血的发生中起一定作用。AL时伴有血小板功能异常,化疗后血小板活化功能有所恢复,本研究为AL时血小板的研究开辟了一种可靠简捷的方法。廊坊市中医院血液科王茂生
关键词 流式细胞术 儿童 急性白血病 血小板活化
急性白血病(AL)占儿童时期恶性肿瘤的首位,随着近年来AL 诊断和治疗方法的不断改进,其疗效取得了长足进步。出血是AL诊治过程中常见的临床症状,并是导致患儿死亡的重要原因。出血的原因是复杂的,血小板减少和血小板功能异常是主要原因之一,Naresh 等曾发现AL时血小板功能异常,包括出血时间、血块回缩、血小板等三因子活性及ADP、肾上腺素、胶原和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集表现异常。但AL时血小板功能的研究未见国内报道。本研究利用FCM方法测定AL患儿各阶段微量全血血小板活化特异单抗PAC-1、CD62p的表达,了解AL不同阶段血小板活化状态及血小板活化功能的变化,探讨AL时血小板活化功能异常对出血的影响及化疗药物对血小板活化功能的影响。
材料和方法
1.材料:主要试剂:(1)荧光标记的血小板单克隆抗体(单抗):PAC-1-FTTC为异硫氰荧光标的抗活化GPIIb/GPIIIa的单抗;CD62p-PE为藻红素标记的抗P-选择素单抗;CD61-PerCP为多甲藻素叶绿素蛋白标记的抗血小板GPIIIa单抗:MigG-PE为藻红素标记的鼠IgG;MigM-FTTC为异硫氰荧光标记的鼠IgM:以上单抗为美国Becton-Dickinson公司产品。(2)ADP激活剂:1×10-1M ADP PBS溶液,ADP为法国AMRESCO公司生产,本室配制。(3)固定液:1%多聚甲醛PBS溶液,本室配制。(4)ACD抗凝剂:3.8%复方枸橼酸钠溶液(上海市血液中心提供)。
2.仪器:FACScan流式细胞仪,美国Bec-ton-Dickinson 公司生产;CELLQUEST分析软件,美国Becton-Diclinson 公司提供。
3.研究对象:2001年12月至2002年8月间在本院住院患儿,诊断和疗效判定符合文献。分为以下4组:(1)对照组,外科畸形择期手术前患儿16例,男12例,女4例,年龄7个月至10岁,平均5岁8个月,其中脑瘫8例,先天斜颈3例,足内翻3例,先天性无肛(二期手术)1例,先天性巨结肠1例。均常规检查血常规、出凝血全套(包括试管法凝血时间、纤维蛋白原定量、KPTT)、肝肾功能结果正常,术后诊断为非炎症性疾病,均于术前取静脉血检测,检测前两周内未行任何治疗。(2)初诊未治组:AL初诊未治患儿21例,男12例,女9例,年龄9个月至15岁,平均6岁8个月,其中ALL18例,ANLL2例(M3 1例,M1 1例)。急性混合细胞白血病1例,其中18例伴有不同程度的出血症状,1例发生颅内出血,均在确诊后化疗前检测。(3)完全缓解组(CRI):初诊未治组患儿中14例,其中男7例,女7例,年龄1岁9个月至14岁,平均7岁2个月,ALL12例,M3 1例,混合细胞急性白血病1例,诱导缓解达完全缓解组(CR)后巩固化疗前检测。(4)持续完全缓解组(CCR):ALCCR2年以上患儿6例,其中男4例,女2例,年龄6岁至15岁,平均9岁,ALL5例,M4b1例,于入院加强治疗前检测。全部患儿检测前7天内未接受血小板输注及抗血小板药物治疗。
4.检测方法:(1)标本采集:用5毫升一次性注射器静脉穿刺顺利,抽取肘静脉血2~4毫升,留取最后抽出的全血1毫升(余血送检其他项目)加入ACD抗凝管(ACD:全血为1:3),轻混1~2次静置,10分钟内送实验室并开始实验。ADP激活:装有1X10-1MADP50ul的聚乙烯试管中加全血450ul,立即涡旋1秒混匀,按厂家说明进行单抗标记。(2)血小板膜CD62p、PAC-1表达测定:采用FCN三色荧光分析法。ADP激活前后的全血各5ul分别加入到装有PAC-1-FTTC、CD62p-PE、CD61-P er-CP各10ul的测试管中,轻轻混匀,室温避光孵育20分钟,分别加入1%多聚甲醛0.5ml(4℃)充分混匀,置4℃冰箱固定30分钟,于24小时内上流式细胞仪分析。每一测试管均作同型对照。PAC-1-FTTC的同型对照为MigM-FTTC;CD62p-PE的同型对照为MigG-PE。调前向角、侧向角光散射和荧光信号均为对数放大。以CD61-PerCP和侧向角光散射双参数设血小板门;以同型对照管设定阴性群体,测定血小板膜PAC-1、CD62p表达阳性百分率。
5.统计方法:实验数据以均数±标准差(χ±s)表示,用SPSS10.0统计分析软件完成t检验、F检验统计学处理。
结果
各组患儿检测时血常规结果及出血症状见表1。从表1可见,初诊未治组21例与对照组比较,血红蛋白、血小板均明显降低,白细胞数明显升高,其中5例白细胞大于50×109/L,18例有不同程度出血症状,1例出现颅内出血;CRI组14例与对照组比较,血红蛋白降低,血小板和白细胞无明显差异,未见出血症状:CCR组6例与对照组比较,血红蛋白、白细胞和血小板均无明显差异,未见出血症状。
AL不同阶段与对照组ADP激活前后血小板膜PAC-1、CD62p表达百分比见表2和图1从表2和图1可见,AL初诊未治组ADP激活后CD62p表达均显著高于对照组(P<0.05),ADP激活后PAC-1表达显著低于对照组(P<0.05),ALCRI组ADP激活前后CD62p表达均高于对照组(p<0.05),AL CCR2年以上组ADP激活后CD62p表达仍高于对照组。
讨论
在白血病诊治过程中,往往发现初诊时血小板并不很低或尚在正常范围内,但是病人表现有皮下出血甚至颅内出血,在化疗过程中病人血小板数已很低,但临床反而没有出血表现。其中原因可能与白血病初诊时肿瘤细胞负荷大,而肿瘤细胞本身可能释放抗凝血活性物质有关。但是白血病时血小板功能是否存在异常尚少见研究报道,仅提及白血病时血小板功能可能有异常,而没有详细说明哪些功能异常及其机理。过去对血浆功能的研究多采用血小板集聚实验或血浆指标,而多数研究是采用了分离富含血小板血浆(PRP)的方法,从而限制了AL血小板显著减少时血小板功能的研究。随着FCM在临床应用的逐渐广泛,流式细胞技术作为研究血小板活化和功能的很好实验技术已在国内外应用。本研究采用流式细胞技术利用血小板活化特异性单抗检测微量全血血小板活化状态和血小板活化功能,避免了PRP分离、洗涤等操作过程中造成的血小板损失、活化和膜蛋白的破坏,为AL血小板减少和血小板功能的研究提供了可靠简捷的方法。我们应用一次性聚乙烯注射器通过熟练的静脉穿刺技术保证抽血顺利,采血后静置尽早(10分钟内)检测,尽量减少标本采集和保存过程中血小板的激活。
血小板膜糖蛋白IIb-IIIa(GPIIb-IIIa)是血小板含量最多的膜蛋白(GP),两个不同的糖蛋白GPIIb与GPIIIa在钙离子的参与下以1:1的比例构成复合物,GPIIb-IIIa复合物是一个完整的功能单位,此复合物的解离导致GPIIb-IIIa受体功能的完全丧失。此复合物三级结构构形对受体功能有极大影响,其构形改变是调节GPIIb-IIIa功能状态的主要机制。当血小板粘附于血管破损处或受到活化作用后即被活化,在钙离子的参与下活化出纤维蛋白原受体,一个纤维蛋白原分子可以同时和至少两个GPIIb-IIIa 结合,因此血小板能通过各自表面的GPIIb-IIIa纤维蛋白原结合而聚集成团。PAC-1是GPIIb-IIIa活化后暴露的纤维蛋白原结合位点单抗,即活化的GPIIb-IIIa抗体为血小板活化的早期标志物。CD62p是血小板a 颗粒膜蛋白单抗,在静息血小板中。颗粒膜蛋白 (CD62p)仅分布于a颗粒膜上,血小板活化时。颗粒膜迅速与质膜融合而在血小板表面表达CD62p,并持续至少1小时,因此CD62p为血小板活化的后期标志物。我们选择这两个指标作为血小板活化标志物,ADP激活前的表达代表体内血小板活化状态,ADP激活后的表达代表体内血小板活化功能。AL患儿血液及骨髓中有大量的白血病细胞,这些细胞对血管内皮的损伤,血小板与肿瘤细胞的作用及作用时释放的生物活性物质是血小板活化和释放的主要原因,由此而造成AL初治前CD62p表达增高,此外AL 初诊时多有不同程度的出血症状也导致血小板活化增强。由于AL时白血病细胞在骨髓中的恶性增生,骨髓的巨核细胞生成减少及功能异常,也可能由于白血病细胞的干细胞起源与巨核细胞干细胞起源相同,而致巨核细胞本身功能异常,其生成的血小板可能发生糖蛋白的质或量异常,导致血小板功能异常,表现为ADP激活前虽然体内血小板活化增加,PAC-1的表达没有明显增加,ADP激活后PAC-1的表达明显降低。现已从MDS和急性体系白血病(AML)中发现克隆异常引起的血小板功能损害。这与苏州医学院发现的急性早幼粒细胞白血病病人可发生获得性血小板无力症以及MDS患者血小板膜GPIIb-IIIa受体血小板表面表达减少是一致的。ADP激活后CD62p表达升高可能是由于ADP激活前CD62p表达已经增高的影响。随着AL的缓解,骨髓造血功能的恢复,ADP激活后PAC-1的表达也恢复,但仍然存在着CD62p表达升高,一方面由于骨髓造血功能恢复后,新生的血小板体积较大功能较好;另一方面虽然已达到完全缓解,但体内还有相当数量的白血病细胞(108个左右),这些细胞仍然可以对血管内皮损伤及与血小板相互作用造成体内血小板活化增加。此外,已有报道柔红霉素和去甲氧柔红霉素可以增加正常血小板的活化相关膜分子(GPIIb-IIIa 、CD62p、CD63)的表达,柔红霉素有最强的影响。故AL患儿完全缓解仍然接受巩固、强化、维持化疗,可能也是造成体内血小板活化增强的原因之一。
综上所述,AL患儿初发时存在着血小板减少,同时伴有血小板功能异常,这种异常可能与白血病的干细胞起源有关,也可能是由于骨髓白血病细胞恶性增生,导致骨髓巨核细胞生成减少或功能异常,进一步导致血小板功能异常,随着白血病的缓解,血小板减少功能的异常,血小板减少和功能异常逐渐恢复。二者为白血病发生严重出血的重要病理生理基础。在临床AL的诊治过程中,对于血小板减少或血小板减少不明显,有明显出血症状者,均应积极给矛单采血小板输注,以纠正血小板数量减少和功能异常,有效地控制出血症状,为有效治疗提供时机。本研究为AL血小板减少时血小板功能的研究开辟了一个可靠简捷的方法。
致谢:本研究过程中受到复旦大学附属儿科院内科七病房陆风娟副教授、高怡谨博士、翟小文博士及全体医务人员和儿研所工作人员的大力支持,特此致谢。
(1)上海复旦大学附属儿科医院儿研所血液室
中国小儿血液2003年第8卷第6期
关键词 流式细胞术 儿童 急性白血病 血小板活化
急性白血病(AL)占儿童时期恶性肿瘤的首位,随着近年来AL 诊断和治疗方法的不断改进,其疗效取得了长足进步。出血是AL诊治过程中常见的临床症状,并是导致患儿死亡的重要原因。出血的原因是复杂的,血小板减少和血小板功能异常是主要原因之一,Naresh 等曾发现AL时血小板功能异常,包括出血时间、血块回缩、血小板等三因子活性及ADP、肾上腺素、胶原和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集表现异常。但AL时血小板功能的研究未见国内报道。本研究利用FCM方法测定AL患儿各阶段微量全血血小板活化特异单抗PAC-1、CD62p的表达,了解AL不同阶段血小板活化状态及血小板活化功能的变化,探讨AL时血小板活化功能异常对出血的影响及化疗药物对血小板活化功能的影响。
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2.仪器:FACScan流式细胞仪,美国Bec-ton-Dickinson 公司生产;CELLQUEST分析软件,美国Becton-Diclinson 公司提供。
3.研究对象:2001年12月至2002年8月间在本院住院患儿,诊断和疗效判定符合文献。分为以下4组:(1)对照组,外科畸形择期手术前患儿16例,男12例,女4例,年龄7个月至10岁,平均5岁8个月,其中脑瘫8例,先天斜颈3例,足内翻3例,先天性无肛(二期手术)1例,先天性巨结肠1例。均常规检查血常规、出凝血全套(包括试管法凝血时间、纤维蛋白原定量、KPTT)、肝肾功能结果正常,术后诊断为非炎症性疾病,均于术前取静脉血检测,检测前两周内未行任何治疗。(2)初诊未治组:AL初诊未治患儿21例,男12例,女9例,年龄9个月至15岁,平均6岁8个月,其中ALL18例,ANLL2例(M3 1例,M1 1例)。急性混合细胞白血病1例,其中18例伴有不同程度的出血症状,1例发生颅内出血,均在确诊后化疗前检测。(3)完全缓解组(CRI):初诊未治组患儿中14例,其中男7例,女7例,年龄1岁9个月至14岁,平均7岁2个月,ALL12例,M3 1例,混合细胞急性白血病1例,诱导缓解达完全缓解组(CR)后巩固化疗前检测。(4)持续完全缓解组(CCR):ALCCR2年以上患儿6例,其中男4例,女2例,年龄6岁至15岁,平均9岁,ALL5例,M4b1例,于入院加强治疗前检测。全部患儿检测前7天内未接受血小板输注及抗血小板药物治疗。
4.检测方法:(1)标本采集:用5毫升一次性注射器静脉穿刺顺利,抽取肘静脉血2~4毫升,留取最后抽出的全血1毫升(余血送检其他项目)加入ACD抗凝管(ACD:全血为1:3),轻混1~2次静置,10分钟内送实验室并开始实验。ADP激活:装有1X10-1MADP50ul的聚乙烯试管中加全血450ul,立即涡旋1秒混匀,按厂家说明进行单抗标记。(2)血小板膜CD62p、PAC-1表达测定:采用FCN三色荧光分析法。ADP激活前后的全血各5ul分别加入到装有PAC-1-FTTC、CD62p-PE、CD61-P er-CP各10ul的测试管中,轻轻混匀,室温避光孵育20分钟,分别加入1%多聚甲醛0.5ml(4℃)充分混匀,置4℃冰箱固定30分钟,于24小时内上流式细胞仪分析。每一测试管均作同型对照。PAC-1-FTTC的同型对照为MigM-FTTC;CD62p-PE的同型对照为MigG-PE。调前向角、侧向角光散射和荧光信号均为对数放大。以CD61-PerCP和侧向角光散射双参数设血小板门;以同型对照管设定阴性群体,测定血小板膜PAC-1、CD62p表达阳性百分率。
5.统计方法:实验数据以均数±标准差(χ±s)表示,用SPSS10.0统计分析软件完成t检验、F检验统计学处理。
结果
各组患儿检测时血常规结果及出血症状见表1。从表1可见,初诊未治组21例与对照组比较,血红蛋白、血小板均明显降低,白细胞数明显升高,其中5例白细胞大于50×109/L,18例有不同程度出血症状,1例出现颅内出血;CRI组14例与对照组比较,血红蛋白降低,血小板和白细胞无明显差异,未见出血症状:CCR组6例与对照组比较,血红蛋白、白细胞和血小板均无明显差异,未见出血症状。
AL不同阶段与对照组ADP激活前后血小板膜PAC-1、CD62p表达百分比见表2和图1从表2和图1可见,AL初诊未治组ADP激活后CD62p表达均显著高于对照组(P<0.05),ADP激活后PAC-1表达显著低于对照组(P<0.05),ALCRI组ADP激活前后CD62p表达均高于对照组(p<0.05),AL CCR2年以上组ADP激活后CD62p表达仍高于对照组。
讨论
在白血病诊治过程中,往往发现初诊时血小板并不很低或尚在正常范围内,但是病人表现有皮下出血甚至颅内出血,在化疗过程中病人血小板数已很低,但临床反而没有出血表现。其中原因可能与白血病初诊时肿瘤细胞负荷大,而肿瘤细胞本身可能释放抗凝血活性物质有关。但是白血病时血小板功能是否存在异常尚少见研究报道,仅提及白血病时血小板功能可能有异常,而没有详细说明哪些功能异常及其机理。过去对血浆功能的研究多采用血小板集聚实验或血浆指标,而多数研究是采用了分离富含血小板血浆(PRP)的方法,从而限制了AL血小板显著减少时血小板功能的研究。随着FCM在临床应用的逐渐广泛,流式细胞技术作为研究血小板活化和功能的很好实验技术已在国内外应用。本研究采用流式细胞技术利用血小板活化特异性单抗检测微量全血血小板活化状态和血小板活化功能,避免了PRP分离、洗涤等操作过程中造成的血小板损失、活化和膜蛋白的破坏,为AL血小板减少和血小板功能的研究提供了可靠简捷的方法。我们应用一次性聚乙烯注射器通过熟练的静脉穿刺技术保证抽血顺利,采血后静置尽早(10分钟内)检测,尽量减少标本采集和保存过程中血小板的激活。
血小板膜糖蛋白IIb-IIIa(GPIIb-IIIa)是血小板含量最多的膜蛋白(GP),两个不同的糖蛋白GPIIb与GPIIIa在钙离子的参与下以1:1的比例构成复合物,GPIIb-IIIa复合物是一个完整的功能单位,此复合物的解离导致GPIIb-IIIa受体功能的完全丧失。此复合物三级结构构形对受体功能有极大影响,其构形改变是调节GPIIb-IIIa功能状态的主要机制。当血小板粘附于血管破损处或受到活化作用后即被活化,在钙离子的参与下活化出纤维蛋白原受体,一个纤维蛋白原分子可以同时和至少两个GPIIb-IIIa 结合,因此血小板能通过各自表面的GPIIb-IIIa纤维蛋白原结合而聚集成团。PAC-1是GPIIb-IIIa活化后暴露的纤维蛋白原结合位点单抗,即活化的GPIIb-IIIa抗体为血小板活化的早期标志物。CD62p是血小板a 颗粒膜蛋白单抗,在静息血小板中。颗粒膜蛋白 (CD62p)仅分布于a颗粒膜上,血小板活化时。颗粒膜迅速与质膜融合而在血小板表面表达CD62p,并持续至少1小时,因此CD62p为血小板活化的后期标志物。我们选择这两个指标作为血小板活化标志物,ADP激活前的表达代表体内血小板活化状态,ADP激活后的表达代表体内血小板活化功能。AL患儿血液及骨髓中有大量的白血病细胞,这些细胞对血管内皮的损伤,血小板与肿瘤细胞的作用及作用时释放的生物活性物质是血小板活化和释放的主要原因,由此而造成AL初治前CD62p表达增高,此外AL 初诊时多有不同程度的出血症状也导致血小板活化增强。由于AL时白血病细胞在骨髓中的恶性增生,骨髓的巨核细胞生成减少及功能异常,也可能由于白血病细胞的干细胞起源与巨核细胞干细胞起源相同,而致巨核细胞本身功能异常,其生成的血小板可能发生糖蛋白的质或量异常,导致血小板功能异常,表现为ADP激活前虽然体内血小板活化增加,PAC-1的表达没有明显增加,ADP激活后PAC-1的表达明显降低。现已从MDS和急性体系白血病(AML)中发现克隆异常引起的血小板功能损害。这与苏州医学院发现的急性早幼粒细胞白血病病人可发生获得性血小板无力症以及MDS患者血小板膜GPIIb-IIIa受体血小板表面表达减少是一致的。ADP激活后CD62p表达升高可能是由于ADP激活前CD62p表达已经增高的影响。随着AL的缓解,骨髓造血功能的恢复,ADP激活后PAC-1的表达也恢复,但仍然存在着CD62p表达升高,一方面由于骨髓造血功能恢复后,新生的血小板体积较大功能较好;另一方面虽然已达到完全缓解,但体内还有相当数量的白血病细胞(108个左右),这些细胞仍然可以对血管内皮损伤及与血小板相互作用造成体内血小板活化增加。此外,已有报道柔红霉素和去甲氧柔红霉素可以增加正常血小板的活化相关膜分子(GPIIb-IIIa 、CD62p、CD63)的表达,柔红霉素有最强的影响。故AL患儿完全缓解仍然接受巩固、强化、维持化疗,可能也是造成体内血小板活化增强的原因之一。
综上所述,AL患儿初发时存在着血小板减少,同时伴有血小板功能异常,这种异常可能与白血病的干细胞起源有关,也可能是由于骨髓白血病细胞恶性增生,导致骨髓巨核细胞生成减少或功能异常,进一步导致血小板功能异常,随着白血病的缓解,血小板减少功能的异常,血小板减少和功能异常逐渐恢复。二者为白血病发生严重出血的重要病理生理基础。在临床AL的诊治过程中,对于血小板减少或血小板减少不明显,有明显出血症状者,均应积极给矛单采血小板输注,以纠正血小板数量减少和功能异常,有效地控制出血症状,为有效治疗提供时机。本研究为AL血小板减少时血小板功能的研究开辟了一个可靠简捷的方法。
致谢:本研究过程中受到复旦大学附属儿科院内科七病房陆风娟副教授、高怡谨博士、翟小文博士及全体医务人员和儿研所工作人员的大力支持,特此致谢。
(1)上海复旦大学附属儿科医院儿研所血液室
中国小儿血液2003年第8卷第6期
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