Eales病与HLA-DRB和-DQB基因位点的关联_专家库

魏世辉主任医师教授 医院：北京301医院科室：眼科

Eales病与HLA-DRB和-DQB基因位点的关联

引言

Eales病亦称视网膜静脉周围炎（Retinal Periphlebitis），是一种病因不明的周边部视网膜小血管炎症性疾病，以中青年男性多见。近些年免疫学、分子生物学和生物化学等多方面的研究表明该病是由多种因素共同作用的结果。1998年Biswas^[1]等首次发现HLA-B51、-DR1和-DR4与Eales病相关联，但此研究尚停留在血清学分型水平，而基因水平的研究目前在国内外仍属空白。本实验应用PCR联合Micro-SSP方法检测了27例北方汉族Eales患者的HLA-DRB、DQB基因位点，旨在揭示Eales病可能的免疫遗传学特点。北京301医院眼科魏世辉

1 对象和方法

1. 1 对象

1. 1. 1 Eales病患者

系解放军总医院眼科门诊及住院Eales病人，共27例，全部为北方汉族男性，平均发病年龄为32.5岁。选择标准^[2]：①以年龄和临床表现为主要诊断依据，间接检眼镜及FFA检查见单眼或双眼典型视网膜静脉周围炎改变，如静脉白鞘、出血灶、新生血管等；②排除其他眼病：视网膜分枝静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、Coat"s病、病毒性视网膜炎等。③排除系统性疾病：Bechcet"s 病、糖尿病、结核、肉样瘤病、白血病、镰状细胞贫血等。

1. 1. 2 对照组

30例，均系本院工作人员。选择标准：①北方汉族男性，年龄在18-45岁之间；②无自身免疫病及遗传病家族史；③无亲缘关系；④全身及眼部检查正常。

1. 2 材料

Gentra DNA 试剂盒、Taq 酶（5U/μl）及Micro SSP™ Generic HLA Class II DNA Typing Tray（Lot #05A）分别由美国Gentra公司、美国Premega公司及美国One Lambda. Inc提供。SSP引物事先包被于96孔Terasaki微孔板并经干燥处理，PCR扩增用的4种dNTP-buffer体系（Micro SSP^TM D-mix）备用，可检出HLA-DRB、DQB1等位基因特异性。

1. 3 方法

1. 3. 1 基因组DNA的制备

取2ml EDTA-K2抗凝外周血，分离白细胞后用Gentra DNA 试剂盒提取DNA，调整DNA浓度为80ng/μl备用。

1. 3. 2 PCR-SSP法检测HLA-DRB、DQB1基因

按试剂盒说明步骤进行：①取Taq酶(浓度为5U/μl )2.5μl 于Micro SSP^TM D-mix管中，轻轻旋转混匀后取D-mix⁺Taq混合液9μl、无菌水1μl加入96孔Terasaki微孔板的阴性对照孔中；②取基因组DNA39μl加入上述D-mix⁺Taq中，轻轻旋转混匀后取该混合液10μl分别加入到微孔板的其余31孔中，加盖密封；③置入Perkin-Elmer 9700 PCR扩增仪中，循环程序如下：96℃ 130s、63℃ 60s 1个循环；96℃ 10s、63℃ 60s 9个循环；96℃ 10s、59℃ 50s、72℃ 30s 20个循环，共计30个循环完成扩增；④转移PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶中（10ul/孔），电泳3-5min (电压100v)，然后置紫外透射仪上观察结果并摄影（图1）。依据Micro SSP™操作手册给出的特异产物带分布及DNA片段的大小指定个体HLA各位点的特异性。

1. 3. 3 统计学处理

以SPSS12.0统计软件包计算疾病优势比（odds ratio, OR）、OR 95%可信区间（confidence interval，CI）及P值（χ²检验，必要时用Fisher’s确切概率法）。以P<0.05为显著性差异判断标准。

2 结果

2. 1 HLA-DRB位点等位基因分布

DRB1*04是Eales组分布频率最高的DRB等位基因（44.4%），与正常对照组比较(20.0%)，差异有显著性（P=0.047，OR=3.20，OR 95% CI为1.003 ~ 10.21）；两组间其他DRB等位基因频率的分布差异无显著性（表1）。

2. 2 HLA-DQB1位点等位基因分布

DQB1*0301是Eales组分布频率最高的DQB1等位基因（51.9%），但两组间各DQB1等位基因频率的分布差异均无显著性（表1）。

3 讨论

HLA复合体遗传区位于6p21.3，全长约4000kb，至1999年10月，已发现的HLA等位基因总和达1028种，能用血清学或细胞学检出的HLA特异性达164种，而且HLA基因位点已被证明与500多种疾病相关联，如强直性脊柱炎、Behcet’s、Vogt-Koyanagi-Harada综合症等^[3]。现广泛应用的HLA基因分型技术主要有PCR-SSO、PCR-SSP、PCR-RFLP等，本研究采用PCR-SSP的方法对Eales患者的HLA-DRB和DQB1基因位点共33种特异性进行了鉴定，此方法具有简洁快速、分辨率高、特异性强的特点，是现有HLA分子生物学分型中较为理想的方法之一。

目前，Eales病是青壮年的主要致盲性疾病，在我国，其发病率仅次于眼外伤。该病病因尚不清楚，虽然近年来国外已相继开展Eales病发病与氧化自由基损伤、免疫因子、全身系统性疾病如结核、寄生虫侵染和神经源性疾病等诸多因素相关性的一系列研究，但Eales病真正的发病机制迄今仍是一个谜。Bertrams等^[4]应用微量淋巴细胞毒实验率先研究了Eales病与HLA-A、B抗原的相关性，但未在48例德国高加索病人中找到Eales病具有遗传易感性的证据。然而，Biswas等却在57例印度Eales病人中发现HLA-B51、-DR1和-DR4的分布频率比对照组明显增高，且单倍型A3-B44和A11-B12呈明显连锁不平衡，提示免疫遗传机制在此病的发生中可能起到重要的作用，并认为此研究结果在一定程度上解释了印度人群易患Eales病的遗传特质^[1]。

本文从基因水平进行了我国北方汉族Eales病与HLA相关性研究的初步尝试。结果显示DRB1*04是Eales组频率最高的DRB等位基因（44.4%），且与对照组比较后统计学上差异有显著性（P₌0.047，OR=3.20），故DRB1*04等位基因可能是Eales病的遗传易感基因，这与Biswas研究小组对印度Eales病人的研究结果类似。在印度及中国大陆，Eales病发病率高可能与DRB1*04在这两个人群中的分布频率较高有关。但是，在本次研究中，Eales研究对象仅27例，可能存在统计学偏倚或不足以显示存在的差异，而且HLA各等位基因频率的分布格局随种族及地域不同而呈现不同特点，目前仍不能排除Eales病与其他HLA基因位点相关的可能。因此，Eales病是否具有遗传易感性及DRB1*04等位基因是否就是Eales病的遗传易感基因还有待更深入的研究来证实。

Eales病与DRB1*04相关联的机制尚不清楚。相关文献表明^[3]，HLA相关疾病的发生可能是由于存在先天的易感基因或免疫应答基因方面的缺陷，在一定条件下，如病原体感染，就会造成疾病的易感。HLA抗原可能是某种病原体物质的受体，两者结合，导致组织损伤，或者HLA抗原自身就具有某种病因物质的分子模拟效应，由此造成机体对该病因物质不能发生有效的免疫应答。还有理论认为特定的HLA等位基因与真正的疾病易感基因处于紧密连锁不平衡，而HLA基因本身并不是引起疾病的真正病因即直接病因，仅仅是遗传标志。

总之，本文发现北方汉族人群中Eales病与DRB1*04基因位点呈正相关，提示Eales病可能具有免疫遗传易感性，这为日后进一步探索Eales病的确切发病机制奠定了基础。随着免疫组化及分子基因研究技术的飞速发展，包括Eales病在内的多种疑难疾病的基础和临床研究必将会有愈来愈多的突破。

附：表１

　　　　　 HLA-DRB和DQB1在Eales组与对照组的分布

HLA ALLELES	Eales (n=27)		Control(n=30)		OR	OR 95% CI	χ²	P
HLA ALLELES	+	%	+	%	OR	OR 95% CI	χ²	P
DRB1*01	0	0	1	3.3	0.30¹⁾			1．000²⁾
*DRB104**	12	44.4	6	20．0	3.20	1.00 ~ 10.21	3.930	0.047
DRB1*07	6	22.2	10	33.3	0.57	0.17 ~ 1.87	0.869	0.351
DRB1*08	4	14.8	3	10.0	1.56	0.32 ~ 7.77	0.022	0.882
DRB1*09	10	37.0	10	33.3	1.18	0.39 ~ 3.53	0.086	0.770
DRB1*10	1	3.7	1	3.3	1.12	0.06 ~ 19.20		1．000²⁾
DRB1*11	2	7.4	7	23.3	0.26	0.05 ~ 1.31	1.645	0.200
DRB1*12	7	25.9	5	16.7	1.75	0.48 ~ 6.37	0.733	0.392
DRB1*13	0	0	2	6.7	0.19¹⁾			0.492²⁾
DRB1*14	1	3.7	3	10.0	0.35	0.04 ~ 3.31	0.168	0.682
DRB1*15	6	22.2	9	30.0	0.67	0.20 ~ 2.22	0.443	0.506
DRB1*17	2	7.4	2	6.7	1.12	0.14 ~ 8.70	<0.001	1.000
DRB3*XX	13	48.1	16	53.3	0.81	0.28 ~ 2.32	0.153	0.696
DRB4*XX	20	74.1	18	60.0	1.90	0.61 ~ 5.91	1.267	0.260
DRB5*XX	6	22.2	9	30.0	0.67	0.20 ~ 2.22	0.443	0.506
DQB1*02	7	25.9	9	30.0	0.82	0.25~ 2.64	0.117	0.733
DQB1*0301	14	51.9	14	46.7	1.23	0.43 ~ 3.52	0.153	0.696
DQB1*0302	2	7.4	3	10.0	0.72	0.11 ~ 4.72	<0.001	1.000
DQB1*0303	10	37.0	11	36.7	1.02	0.34~ 3.01	0.001	0.977
DQB1*04	5	18.5	2	6.7	3.18	0.59 ~ 17.10	0.916	0.339
DQB1*05	4	14.8	5	16.7	0.87	0.21~ 3.68	<0.001	1.000
DQB1*06	9	33.3	11	36.7	0.86	0.29 ~ 2.60	0.069	0.792