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- NGF对脱髓鞘性视神经炎小鼠视网膜神经
- 作者:魏世辉|发布时间:2011-02-09|浏览量:1569次
视神经炎是一种急性自限性疾病,可引起视力下降,大部分病人几周后可以自行恢复。然而,在视神经炎实验治疗组中,大约有40%的病人发生一定水平的永久性的视力降低[1].随后的研究显示视网膜神经纤维层变薄,标记表明RGC轴突减少,这就说明了视神经炎发生后视力的降低[2,3]。有些MS患者没有发生视神经炎,但由于视网膜神经纤维层变薄也可导致相应的视力下降,这表明在此类疾病中RGC轴突的减少是视力降低的主要原因。MS和EAE的研究表明轴突损伤和神经元的丢失是产生永久性神经学功能障碍的主要因素,这些研究结果是一致的。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是神经营养因子家族中最早被发现,目前研究最为透彻的,具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子[4];是维持中枢神经和周围神经功能的重要活性因子。由于NGF对神经细胞具有营养和保护作用,临床工作者开始研究用NGF来治疗视网膜和视神经疾病。越来约多动物实验证明,NGF对视网膜缺血性损害、遗传性视网膜色素变性、视神经损伤有明确疗效,对视网膜神经节细胞有很好的保护作用[5]。基于以上研究结果,我们认为NGF对于脱髓鞘性视神经炎视功能的降低可能有一定的治疗价值。本研究通过玻璃体注射外源性鼠神经生长因子,观察其对小鼠视神经炎视网膜神经组织的保护作用,为探索对具有保护作用的药物提供一定的实验依据。北京301医院眼科魏世辉
1、材料和方法
1.1实验材料
实验动物:实验用C57BL/6(H-2b)小鼠,雌雄不限,8-10周龄,由中国人民解放军总医院实验动物中心提供。动物饲养于室温24士2℃的环境中,维持光一暗12小时循环交替,并给予充足的食料和洁净饮水。饲养2一7天后,用于实验。
主要试剂:鼠源MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK):由北京赛百盛基因技术有限公司合成,采用反高校液相色谱仪(C18柱)分离钝化,纯度在95%以上。完全弗氏佐剂(CFA):购自美国Sigma公司;百日咳菌苗 和结核杆菌冻干粉均购自北京天坛生物制品研究所。注射用鼠神经生长因子(1.5mg/ml)购自舒泰神药业有限公司。
2.方法
2.1 实验动物分组:50只C57BL/6小鼠随机分为3组:CON组10只、BSS+EAE组和NGF+EAE组各20只,实验动物由本院实验动物中心提供。
2.2 EAE模型的建立及神经功能评分:将300ug MOG35-55溶于 200ul PBS 液再与200ul CFA 混合,添加结合杆菌使其终浓度为2mg/ml,用电子搅拌棒冰浴下搅拌5-10分钟达到充分乳化。最终需鉴定是否乳化完全,方法是将一滴乳剂滴入水中,如不散开漂在水面则为乳化完全;如立即散开,则未乳化充分。尽量在避光、低温、无菌条件下操作。EAE组双侧腹壁分四点皮下注射混合乳剂,对照组直接将200ulPBS液和200ulCFA充分乳化后分双侧腹壁分四点皮下注射。两组均于免疫前24小时和免疫后24小时每只小鼠腹腔注射100ul百日咳菌液(含活菌2×109个)。
每天由观察者记录每只小鼠的体重并进行神经功能评分,直至免疫后的30天。
神经功能评分:
0分:无临床症状;
1分:尾部张力降低或轻度步态笨拙;
2分:尾部无张力或中度步态异常,双后肢无力,被动翻身后可以恢复;
3分:双后肢瘫痪,被动翻身后不能恢复,但给予刺激后可以挪动;
4分:双后肢瘫痪,前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁;
5分:濒死状态或死亡。
2.3 玻璃体腔注射
将小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠0.15ml,麻醉后固定于实验台上,滴复方托品酰胺散瞳,手术显微镜下用5ul微量注射器于颞上象限角膜缘后0.5mm处刺入眼球壁,然后倾斜进入玻璃体腔,缓慢注射3ug/2ul NGF于NGF+EAE组小鼠玻璃体腔,针尖在玻璃体腔内停留20秒后缓慢抽出,结膜囊内涂金霉素眼膏。BSS+EAE组只注射BSS溶液2ul,余处置同前,在免疫后的第4天和第10天分别对两组小鼠进行玻璃体注射。
2.4 视觉电生理检查
根据我们对小鼠视神经炎模型病程中视觉电生理的监测,f-VEP和f-ERG的改变先于临床症状的发生,因此我们选择免疫后的第7天和第14天各取10只小鼠(20眼)进行f-VEP和f-ERG检查,以评价NGF的治疗效果。
2.5 视神经组织形态学观察
在免疫后第7天和第14天各组小鼠做完f-VEP、f-ERG检查后用4%的多聚甲醛经心脏灌注,钝性分离取出视神经和眼球。对视神经采用HE染色、Luxol Fast Blue髓鞘染色、Bielschowsky银染分别评估炎性细胞浸润、髓鞘脱失程度和轴突病理改变。
2.6 视网膜神经节细胞凋亡的检测
取视网膜做石蜡切片,使用原位细胞凋亡(TUNEL)检测其视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡。显微镜下观察,TUNEL阳性表达为细胞核呈棕黄色染色。每个标本取三张切片,400倍下每张切片随机取5个视野计数TUNEL染色阳性的RGCs,分别计算凋亡指数(AI),AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%,取其平均值为该例标本凋亡指数。
2.7 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件包进行数据分析。对数据进行正态性检验后用
t检验的方法分析,实验数据采用均数±标准差(x±s)表示。
3. 结果
3.1 MOG35-55免疫小鼠EAE发病情况、体重变化和功能评分
两组患病小鼠均表现为精神萎靡、体重下降、尾无力下垂,后肢或四肢麻痹、大小便失禁。BSS+EAE组小鼠EAE平均发病时间为14.4±2.48d,NGF+EAE组小鼠EAE平均发病时间为16.1±1.48d,可见NGF+EAE组发病潜伏期有延长趋势,但统计学分析无显著性意义(p<0.05)。临床症状的评分(图1)在发病当天两组相似:NGF组平均临床评分0.6±0.1,对照组平均临床评分0.7±0.1。统计学比较无显著性差异(p<0.05)。
图1-1 小鼠免疫后的每个时间点平均神经功能评分
3.2 视觉电生理检查
我们在免疫后的第7天和第14天对小鼠进行f-VEP和f-ERG的检查,结果见(表2-1)。EAE组每眼各波结果在正常值范围之内认为没有改变。
f-VEP的变化(表1-1):在p.i.7d, 所有动物均可引出清晰的VEP波形, NGF+EAE组有较好的VEP结果,统计学分析LN1、LP、AP和BSS+EAE组相比无显著性差异(P>0.05)。在p.i.14d,NGF+EAE组和BSS+EAE组f-VEP的结果相似: NGF+EAE组有10眼VEP发生改变,其中5眼未引出波形;BSS+EAE组有12眼VEP发生改变,其中6眼未引出波形。我们对VEP改变有波形眼进行统计学比较,LN1、LP和AP两组均无显著性差异(P>0.05)。
表1-1 NGF+EAE组与BSS+EAE组不同时间点f-VEP P 波潜伏期的变化(x±s,ms)
|
LN1(ms) |
LP(ms) |
AP(mv) | |
i.d.0d (n=20) |
CON |
52.70±2.06 |
72.15±2.33 |
46.25±1.74 |
BSS+EAE |
53.20±0.92 |
72.03±1.19 |
43.63±2.10 | |
NGF+EAE |
53.18±1.08 |
71.00±1.00 |
42.61±2.13 | |
i.d.7d |
CON(n=10) |
53.55±1.30 |
60.30±1.69 |
42.04±2.37 |
BSS+EAE(n=7) |
65.43±8.27 |
72.35±0.63 |
15.99±4.88* | |
NGF+EAE(n=5) |
62.4±7.38 |
88.07±12.16* |
19.12±7.16* | |
i.d.14d |
CON(n=10) |
53.50±1.13 |
73.70±1.06 |
40.70±1.60 |
BSS+EAE(n=6) |
107.83±24.27* |
137.33±21.98* |
7.43±3.16* | |
NGF+EAE(n=5) |
105.4±26.39* |
135.4±26.50* |
6.16±2.96* |
与CON相比,*p≤0.05;和BSS+EAE相比,▲p≤0.05;EAE组n为记录结果超出正常值范围的眼的数目
f-ERG的变化(表1-2,图2-1,图2-2):为了研究NGF对RGCs的电生理功能的影响,我们对各组小鼠不同时间点进行f-ERG检查。在p.i.7d, BSS+EAE组和NGF+EAE组各有6眼和5眼,其a波,b波潜伏期有延长趋势,幅值降低,超出正常值范围,但统计后两组比较无显著性差异(P>0.05);在p.i.14d,NGF+EAE组有较好的结果,NGF+EAE组3/20眼未引出波形,6/20眼各波潜伏期和幅值超过正常值范围;BSS+EAE组6/20未引出波形,7/20眼各波潜伏期和幅值超过正常值范围。我们对两组结果进行分析,NGF+EAE组ERG改变眼b波潜伏期、幅值和BSS+EAE组比较有缩短趋势,差异有显著性意义(P<0.05)。
表1-2 NGF+EAE组与BSS+EAE组不同时间点ERG 的变化(x±s)
|
La(ms) |
Aa(mv) |
Lb(ms) |
Ab(mv) | |
i.d.0d (n=20) |
CON |
21.80±0.95 |
115.30±8.66 |
60.90±1.05 |
459.70±9.75 |
BSS+EAE |
22.15±0.80 |
129.32±8.11 |
61.20±1.28 |
458.75±20.89 | |
NGF+EAE |
22.50±0.71 |
134.36±8.96 |
61.03±1.08 |
466.72±16.11 | |
i.d.7d |
CON(n=10) |
21.80±1.09 |
122.98±7.87 |
60.30±1.69 |
457.17±11.67 |
BSS+EAE(n=6) |
43.33±3.40* |
51.04±16.11* |
88.58±7.07* |
133.12±29.87* | |
NGF+EAE(n=5) |
43.15±2.32* |
49.94±13.37* |
89.50±6.49* |
136.59±23.47* | |
i.d.14d |
CON(n=10) |
21.35±1.226 |
120.36±9.14 |
60.15±1.44 |
454.93±13.49 |
BSS+EAE(n=6) |
49.25±4.61* |
39.33±23.69* |
125.00±10.64* |
83.21±48.89* | |
NGF+EAE(n=7) |
45.21±3.87* |
55.5±14.17* |
94.57±7.92*▲ |
124.2±27.39*▲ |
与CON相比,*p≤0.05;和BSS+EAE相比,▲p≤0.05;EAE组n为记录结果超出正常值范围的眼的数目
BSS+EAE NGF+EAE BSS+EAE NGF+EAE
图1-2:p.i.14d,两组b波潜伏期的对比 图1-3:p.i.14d,两组b波潜伏期的对比
3.3 视神经组织形态学检查
对于f-VEP改变眼,ON的病理检查在两组相似。ON的组织病理学检查表明NGF+EAE组和BSS+EAE组结果无显著性差异。在p.i.7d,NGF+EAE组和BSS+EAE组视神经纵切面HE染色(图2A,B)均未见明显异常;LFB染色(图3A,B;图5A,B)均可见视神经髓鞘排列紊乱、不清晰,无明显髓鞘脱失;Bielschowsky银染(图6A,B)可见染成黑色的轴突,间质轻度空泡化。在p.i.14d,NGF+EAE组和BSS+EAE组视神经纵切面HE染色(图2C,D)均可见中度的炎性细胞浸润。纵切面LFB染色(图3C,D)均可见片状不规则髓鞘脱失去,脱失区域颜色变浅。Bielschowsky银染(图6C,D)视神经轴突结构紊乱,疏松减少,空泡化明显。视神经横切面LFB染色用于测量脱髓鞘面积(图5C-D), NGF+EAE组和BSS+EAE组视神经的分别为脱髓鞘面积占横截面比例分别为31.50±8.72%,29.91±10.00%,统计学比较无显著性意义(P>0.05)。
3.4 视网膜神经节细胞凋亡观察
在p.i.7d,两组TUNEL染色未见明显RGCs凋亡(图6A,B)。在p.i.14d,BSS+EAE组和NGF+EAE组TUN EL 染色RGCs均见明显凋亡(图6C,D);凋亡指数分别为(34.14±3.83)%、(15.18±3.36)%, NGF+EAE组TUNEL阳性细胞数较BSS+EAE组明显减少,其凋亡指数两组比较有显著性差异(P <0.01)。
4.讨论
在实验性视神经炎模型中,自身免疫性反应和髓鞘脱失是轴突损害和RGCs的始动因素,早期就可发生轴突的损伤和RGCs 的凋亡[6]。但是我们知道轴突凋亡也存在于其他视神经疾病,直接的轴突撞击引起的视神经损伤的动物模型也可导致轴突损伤和RGC凋亡,提示我们也许轴突损伤是引起RGC凋亡的最终通路。在一个模型中防止轴突损伤、保护神经元的治疗在其他模型中也有效。
神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现[1],具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子。一些研究者发现NGF 对RGCs 具有一定保护作用。在神经系统遭遇机械、化学多种损伤时,外源性神经生长因子可以保护神经元,减轻伤害,促进神经纤维再生,有利于功能恢复[7]。越来越多的动物实验研究证明,NGF对于视网膜缺血性损害和视网膜化学性损伤有明确疗效,对视网膜神经节细胞有很好的保护作用[8]。正常情况下,NGF不能通过正常的血-视网膜屏障[9]。但EAE小鼠发病本身存在血脑屏障的破坏既然轴突的损伤和神经节细胞凋亡是脱髓鞘性视神经炎早期的和普遍的事实[10],那么在ON的治疗策略上应当选择神经保护的药物,结合抗炎症和免疫抑制剂的综合治疗措施。
我们在活体病人不能监测到神经元的凋亡,因此视神经炎的病理改变和RGCs的凋亡途径都来自于对动物模型的实验研究。我们的研究已经证实MOG诱导的视神经炎模型存在严重的RGCs的凋亡,因此可作为是研究神经保护药物作用的理想模型。我们发现视网膜的功能改变发生在免疫后的第7天,即EAE临床症状发生前1周左右,免疫后的第14天可以检测到严重的RGCs的凋亡持续进展直到免疫后的第20天,这和Hobom等[11]研究结果基本一致。基于以上研究背景,NGF的神经保护治疗开始于免疫后的第4天,免疫后的第10天再次给药,在疾病临床前期就开始预防RGCs的凋亡.
在许多研究中,玻璃体注射是一种传递营养因子、药物、细胞因子等到达视网膜发挥其作用的一种很有效、可控的操作方法。玻璃体容积的相对独立性可以提高药物的有效浓度和延长药物的作用时间[12],尤其适合生物半衰期短的药物。
本实验发现NGF对视神经炎小鼠的临床症状和体重无明显影响,我们认为这是由于我们注射于玻璃体腔的浓度较低,剂量微小,不足以对全身起到影响,从另一方面也说明了视神经炎小鼠建模的稳定及这种治疗方法的相对安全。闪光视网膜电图结果发现,在免疫后的第14天暗适应NGF+EAE组小鼠ERG b波振幅和潜伏期与BSS+EAE相比潜伏期明显缩短,振幅降低,提示NGF治疗组小鼠视网膜功能与对照组相比有一定程度的改善,我们推测这可能与其对视网膜神经组织的保护作用相关。TUNEL检测发NGF+EAE组小鼠RGCs细胞有较好的存活率,与BSS+EAE组相比有非常显著的统计学意义(P<0.01) ,这表明NGF对视网膜的功能和RGCs的存活有保护作用。总之,我们认为治疗组小鼠视网膜功能的改善可能与神经组织保护作用相关。近年,一些学者对可以延迟神经节细胞的丢失,保存神经节细胞存活的作用进行了较多的研究[13,14]。
综上所述,本实验结果提示NGF对脱髓鞘性视神经炎小鼠视网膜功能损害有一定程度的改善作用,可以减少神经节细胞层调亡的数量,可以作为一种神经保护治疗。虽然免疫调节和抗炎药物仍然是治疗视神经炎的主要方法,如果全身给药,NGF积聚在肝脏到达视网膜的药物可能不充足,由于半衰期比较短和其炎性副作用,其临床应用受到限制[15]。故需进一步的实验来研究运用的最佳时间,适当的使用剂量,以产生最大的视网膜神经组织保护作用,另外目前尚没有保护脱髓鞘性视神经炎视网膜神经组织机制的相关报道,这些都是我们下一步需要进行研究的方向。
图2A:p.i.7d BSS+EAE组视神经 图2B:p.i.7d NGF+EAE组视神经
HE染色 (×100) HE染色(×100)
图2C:p.i.14d BSS+EAE组视神经 图2D:p.i.14d NGF+EAE组视神经
HE染色(×100) HE染色(×100)
图3A:p.i.7d BSS+EAE组视神经 图3B:p.i.7d NGF+EAE组视神经
纵切面LFB染色(×200) 纵切面LFB染色(×200)
图3C:p.i.14d BSS+EAE组视神经 图3D:p.i.14d NGF+EAE组视神经
纵切面LFB染色(×200) 纵切面LFB染色(×200)
图4A:p.i.7d BSS+EAE组视神经 图4B:p.i.7d NGF+EAE组视神经
横切面LFB染色(×200) 横切面LFB染色(×200)
图4C:p.i.14d BSS+EAE组视神经 图4D:p.i.14d NGF+EAE组视神经
横切面LFB染色(×200) 横切面LFB染色(×200)
图5A:p.i.7d BSS+EAE组视神经 图5B:p.i.7d NGF+EAE组视神经
Bielsehowsky银染(×100) Bielsehowsky银染(×100)
图5C:p.i.14d BSS+EAE组视神经 图5D:p.i.14d NGF+EAE组视神经
Bielsehowsky银染(×100) Bielsehowsky银染(×100)
图6A:p.i.7d,BSS+EAE组TUNEL染色 图6B:p.i.7d,NGF+EAE组TUNEL染色
(×400) (×400)
图6C:p.i.14d,BSS+EAE组TUNEL染色 图6D:p.i.14d,NGF+EAE组TUNEL染色
可见明显棕黄褐色阳性凋亡细胞(×400) 可见棕黄褐色阳性凋亡细胞(×400)
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