食管癌细胞系对光敏剂Photofrin-Ⅱ的吸收和排出研究（一）

引言

光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）是近20年发展起来的一种新的治疗恶性肿瘤的方法，其独特的优点是能选择性地消灭局部肿瘤而不危及正常组织，而且并发症少、实施简便、可反复实施^[1]。PDT的基础是肿瘤组织能选择性摄取光敏剂，病灶部位光敏剂浓度相对正常组织高，光敏剂优先聚集于肿瘤细胞的机制尚不完全清楚，可能为肿瘤细胞营养不良，缺乏卟啉类物质，也可能与肿瘤细胞的高增生速率、淋巴引流异常、血管泄漏或光敏剂与新生物细胞上标志性分子之间的较特异性相互作用（肿瘤细胞亲和力）有关，如某些细胞器如：线粒体、溶酶体可能存在对光敏剂的高亲合力。此外，肿瘤分泌的血管内皮生长因子在光敏剂的集聚中也可能起重要作用，由于大多数卟啉类光敏剂局限于肿瘤血管内，而且由其引起的PDT首先表现为血管损伤，因此光敏剂与肿瘤血管的特异性相互作用（肿瘤血管亲和力），也可能是光敏剂集聚的原因^[2]河南科技大学第一附属医院肿瘤科高社干

人永生化食管上皮细胞系SHEE仍保留原代鳞状上皮细胞的特征，它的癌变细胞系SHEEC与SHEE相比既有其同源性，又具有肿瘤特征，用来在体外进行研究肿瘤细胞是否比正常细胞对光敏剂具有特出的亲和力，完全排除了血管亲和力因素，有着独特的优势，国内外未见有关报道。光敏剂Photofrin-Ⅱ是美国FDA唯一批准用于临床治疗肿瘤的光敏剂，与第一代光敏剂HPD相比，其肿瘤光生物活性更高，毒副作用更小^[3]，非常适合光敏剂吸收排出规律的研究。

本实验以人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC为研究对象，采用荧光分光光度法检测不同孵育浓度、不同孵育时间下人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC内光敏剂Photofrin-Ⅱ的荧光含量，以及一定浓度Photofrin-Ⅱ孵育后不同时间点SHEE及其SHEEC内光敏剂Photofrin-Ⅱ的荧光含量，以明确人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC对光敏剂Photofrin-Ⅱ的吸收、排出规律，探讨肿瘤细胞是否比正常细胞对光敏剂具有特殊的亲和力，为体外细胞培养的光动力实验研究选择最佳光敏剂剂量和最佳光照时机提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验对象

人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所曾毅院士和汕头大学医学院沈忠英教授建株：

采用基因转染技术以病毒作为载体将HPV18型E6E7基因导入到正常胎儿食管上皮细胞中，经筛选获得了永生化食管上皮细胞系SHEE^[4,5]，然后连续培养传代。SHEE的表型仍保留原代上皮细胞培养的特征，表现为单层生长和锚锭依赖性生长，在软琼脂培养不形成克隆，接种裸鼠未成瘤。从生物学行为看来，SHEE细胞株接近于其来源细胞，保存其增殖能力和分化的潜力。

在永生化食管上皮细胞系SHEE的基础上通过促癌物十二烷基葵豆寇（12-O-tetradeanoyl-phorbol-13-acetate, TPA）诱导，使SHEE发生恶性转化，从而又建立了食管癌细胞系?SHEEC^[6]。

1.2主要试剂及配制

1.2.1 光敏剂：photofrin-Ⅱ，加拿大Sinclair Pharmaceuticals公司生产，75mg/支，4℃避光保存。

1.2.2 胎牛血清：美国GIBCO公司产品。

1.2.3 胰蛋白酶：美国Hyclone公司产品。

1.2.4 M 199细胞培养基：美国GIBCO公司产品。

1.2.5 PBS贮存液（10×）的配制：常规配置后，室温密封保存备用。

1.2.6 PBS使用液配制：取PBS贮存液50ml，加三蒸馏450ml，经101.3Kpa, 121.3℃，灭菌15min，置室温或4℃密封保存备用。

1.2.7 细胞冻存液的配制（10ml）

取M199培养液6.8ml，胎牛血清2ml，DMSO 1.0ml，抗生素溶液0.1ml，5.6%的NaHCO₃ 0.1ml，随配随用。

1.2.8 抗生素溶液（100×）配制

取链霉素（双氢）1g（100万μg），溶于三蒸水100ml中，弃去20ml后，以剩余的80ml溶液溶解青霉素（钠盐）80万U，即每毫升含青霉素10000U，含链霉素10000μg，用0.20μm微孔滤器（美国Pall公司）过滤除菌，按每份5ml分装，-20℃密封保存备用。

1.2.9 M199培养液的配制

取美国GIBCO公司Medium 199粉一袋（9.5g），加NaHCO₃ 2.0g，在烧杯中用少许三蒸水调成糊状，更多的三蒸水并搅拌均匀，移入1000ml定容烧瓶中，用三蒸水反复冲洗试剂袋中和烧杯中残留的试剂，勿使试剂残留，造成最终浓度降低，用三蒸水定容至1000ml，用1mol/L NaOH或HCL调节PH值至6.8~7.0，用0.20μm微孔滤器（美国Pall公司）过滤除菌，按每份200ml分装，-20℃保存备用。

1.2.10 M199完全培养液的配制

取M199培养液200ml，加入胎牛血清23ml（10%），加入抗生素溶液（100×）2.4ml，4℃密封保存备用。

1.2.11 0.25%胰蛋白酶溶液的配制

取美国GIBCO公司胰蛋白酶粉1.0g，用少量PBS调成糊状，再补充PBS至100ml，搅拌均匀，置于室温环境4h并不时搅拌震荡，用0.20μm微孔滤器（美国Pall公司）过滤除菌，按照1ml量分装成小瓶，-20℃密封保存，临用时将其用PBS液稀释成1/4浓度，即为0.25%的胰蛋白酶。

1.3 主要设备

荧光分光光度仪：F-3010型，日本HITACHI公司产品。

紫外分光光度仪：UV-2201型，日本SHIMADZU公司产品。

CO₂孵育箱：MCO-175型，日本SANYO公司产品。

倒置生物显微镜：TE2000-U型，日本NIKON公司产品。

低温冰箱：MDF-330型，日本SANYO公司产品。

血球计数板：XBK-25型，上海医用光学仪器厂产品。

细胞培养瓶、细胞培养板：法国FALCON公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 光敏剂Photofrin-Ⅱ荧光激发光谱和发射光谱测定

用不含胎牛血清的M199培养液将光敏剂Photofrin-Ⅱ配制成30μg/ml的浓度，在F-3010型荧光分光光度仪上自动扫描，波长范围200~800nm，灵敏度为±0.1nm，夹缝3.3nm，测出光敏剂Photofrin-Ⅱ的最大荧光激发波长和最大荧光发射波长。

1.4.2培养用液的吸收光谱测定^[7]

随机抽取M199培养液、M199完全培养液、PBS液、细胞培养过程中收集的残余培养基，在UV-2201型紫外可见光分光光度仪上检测上述溶液对波长为220~800nm的光透射率。

靶细胞实际接受光剂量的根据公式：靶细胞实际接受的光剂量=体外光照系统光源的光照剂量×细胞培养液的投射率。

1.4.3 人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC对光敏剂Photofrin-Ⅱ吸收规律的检测

1.4.3.1 人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC的培养、传代^[8]

人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC在10%小牛血清的M199细胞培养液中37℃，5%CO₂孵育箱中常规细胞培养、传代（见彩图1、2）。

1.4.3.2 实验分组及处理

分别取对数生长期的人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC，0.25%胰蛋白酶液消化（见彩图3、4），配成1.0×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，每孔1ml。置于37℃，5%C0₂孵育箱中继续培养24h，将细胞系SHEE及SHEEC分别随机分成43组，每组3复孔，PBS液冲洗3遍。

1.4.3.2.1 吸收浓度检测组

其中13组细胞系SHEE及SHEEC在避光条件下更换为不含胎牛血清的M199液配制的光敏剂Photofrin-Ⅱ（见彩图5、6），光敏剂最终浓度分别为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml，置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养120min后，取出培养板，用PBS冲洗3遍。采用胰蛋白酶消化加低渗裂解细胞，每孔加入0.25%的胰蛋白酶0.5ml，置37℃、5%CO₂恒温培养箱中充分消化后加入无菌三蒸水0.5ml，反复吹打，镜下不见完整细胞为宜，用荧光分光光度仪测定SHEE和SHEEC细胞内光敏剂的荧光强度值，探索SHEE和SHEEC细胞对光敏剂Photofrin-Ⅱ不同浓度的吸收规律。

1.4.3.2.2 吸收时间检测组

另外30组细胞系SHEE及SHEEC在避光条件下更换为不含胎牛血清的M199液配制的光敏剂Photofrin-Ⅱ，光敏剂终浓度分别为30μg/ml、15μg/ml、10μg/ml（根据吸收浓度检测组的数据），置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中分别培养0min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min后，取出培养板，用PBS冲洗3遍。采用胰蛋白酶消化加低渗裂解细胞，每孔加入0.25%的胰蛋白酶0.5ml，置37℃、5%CO₂恒温培养箱中充分消化后加入无菌三蒸水0.5ml，反复吹打，镜下不见完整细胞为宜，用荧光分光光度仪测定SHEE和SHEEC细胞内光敏剂的荧光强度值。探索SHEE和SHEEC细胞对光敏剂Photofrin-Ⅱ在不同时间情况下的吸收规律。

1.4.3.3 测定方法:

处理后的样品直接在F-3010型荧光分光光度仪上测定其荧光强度值，测定条件为：激发波长395nm，发射波长634.1nm，灵敏度±0.1nm，夹缝3.3nm，由显示器直接读出最大荧光强度值，每组取3孔平均值表示人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC细胞光敏剂Photofrin-Ⅱ含量。

1.4.4 Photofrin-Ⅱ在人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC中的排出规律的研究

1.4.4.1 人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC培养

同实验1.4.3.1的细胞培养。

1.4.4.2 实验分组和处理

分别取对数生长期的人永生化食管上皮细胞系SHEE及其癌变细胞系SHEEC，0.25%胰蛋白酶液消化，配成1.0×10⁵个/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，每孔1ml。置于37℃，5%C0₂孵育箱中继续培养24h，将细胞随机分成21组，每组3复孔，PBS液冲洗3遍后，在避光条件下更换为不含胎牛血清的M199液配制的光敏剂Photofrin-Ⅱ，光敏剂终浓度分别为10μg/ml、15μg/ml、30μg/ml，置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中继续孵育150min，然后弃去含光敏剂Photofrin-Ⅱ的M199液，PBS冲洗3遍后，更换为不含光敏剂Photofrin-Ⅱ的M199液，分别于0min、15min、30min、45min、60min、90min、120 min采用胰蛋白酶消化加低渗裂解细胞，每孔加入0.25%的胰蛋白酶0.5ml，置37℃、5%CO₂恒温培养箱中充分消化后加入无菌三蒸水0.5ml，反复吹打，镜下不见完整细胞为宜，用荧光分光光度仪测定SHEE和SHEEC细胞内光敏剂的荧光强度值，探索SHEE和SHEEC细胞对光敏剂Photofrin-Ⅱ在不同浓度情况下的排出规律。

1.4.4.3 测定方法:同实验1.4.3.3的荧光含量测定。