参黄冲剂对衰老患者P16基因mRNA表达及临床疗效的影响

 

 

 

摘要：目的 应用基因测序技术，通过观察参黄冲剂对衰老患者P16基因mRNA定量表达等相关内环境指标影响与个体反应差异的相关性，评价参黄冲剂在延缓衰老方面的作用和临床疗效。方法 采用随机、单盲、对照研究方法，共选择60例符合条件的衰老患者纳入研究及统计分析。所有患者被随机分为参黄冲剂治疗组和对照治疗组，每组30人。参黄冲剂组进行常规治疗基础上加用参黄冲剂治疗（江苏省中医院协定处方），每次10?，每日3次。对照组进行常规系统治疗，并给予甲磺酸双氢麦角毒碱片，每次1mg，每日3次。各组均连续服药8周为1个疗程，观察时间为1个疗程。结果 衰老患者肾阴虚、肾阳虚2种证型P16基因的序列特征未见突变改变。参黄冲剂组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）明显变大（p<0.05），对照组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）无明显差异（p>0.05）；参黄冲剂组治疗后肾阴虚、肾阳虚两种证型P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）未见明显差异（p>0.05）。参黄冲剂组与对照组在治疗前的衰老患者P16基因mRNA定量表达无统计学意义(p>0.05)，二者之间具有可比性；在治疗后两组比较具有统计学意义(p<0.05)。两组治疗后衰老患者临床疗效比较，参黄冲剂组30例，显效3例，有效21例，无效6例，总有效率80.0％；对照组30例，显效1例，有效12例，无效17例，总有效率43.3％；经统计学处理，两组间有效率有统计学意义（p<0.01）。结论 参黄冲剂治疗老年肾虚患者，可有效改善临床衰老的临床症状，提高日常生活能力；而且参黄冲剂可减少P16基因mRNA的表达，其机制可能是通过抑制衰老细胞的增殖而达到延缓衰老的作用，从而起到抗衰老的作用，但衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚P16基因的序列特征未见突变改变，为进一步诠释中医辨证施治衰老的机制提供了分子生物学的依据。江苏省中医院老年科韩旭

关键词  P16基因；mRNA定量表达；遗传；参黄冲剂；衰老；辨证论治

课题项目：2008年度江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目资助方案（卫生行业内科）D类资助项目27号

随着我国人口老龄化的加快，积极寻找延缓衰老并防治衰老相关疾病的有效手段尤为重要。本研究在以往课题研究基础上，以中医理论为指导，采用遗传药理学方法研究衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚之间的遗传差异，通过P16基因测序和其信使核糖核酸（mRNA）表达来分析衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚的基因序列特征，并用参黄冲剂为代表的制剂进行中药治疗干预，探寻机体对中药干预产生的个体反应差异和P16基因mRNA表达等相关内环境指标的相关性，并对参黄冲剂延缓衰老的作用和临床综合疗效进行客观评价，为进一步诠释中医辨证施治衰老的机制提供分子生物学的依据。现将结果报道如下：

1  一般资料

本研究60例受试者均来源于江苏省中医院老年科门诊和病房，男女不限，年龄为60-80周岁，无明显心、脑、肺、肝、肾及内分泌等器质性疾病；采用随机、单盲、对照研究方法进入参黄冲剂治疗组、对照组，每组各30例。

1.1两组性别对比

参黄冲剂治疗组男、女性分别为24人、6人；对照组男、女性分别为26人、4人；两组年龄分布没有显著性差异（p>0.05）。

1.2 两组年龄对比

参黄冲剂治疗组年龄最高80岁，最低62岁；对照组年龄最高78岁，最低60岁；两组年龄分布没有显著性差异（p>0.05）。

1.3两组证型对比

参黄冲剂治疗组肾阴虚型14例，肾阳虚型16例；对照组肾阴虚型12例，肾阳虚型18例；两组证型分布没有显著性差异（p>0.05）。

两组在性别、年龄、证型分布上皆具有可比性。

2  诊断标准和症状量化分级标准

2.1衰老的辨证诊断标准：参照“中医虚证参考标准”^[1]制定，分为肾阳虚证、肾阴虚证2个证型。

肾阳虚证: 腰膝酸软、性欲减退、畏寒肢冷、夜尿频多、下肢浮肿、腰膝酸软、精神萎靡、动则气短，舌质淡，脉弱。

肾阴虚证：头目眩晕、视力模糊、耳鸣或耳聋、腰膝酸软、身疲乏力、烦热汗出、咽干便燥、脱发或发白、失眠健忘、性功能减退、尿后余沥或不禁，齿摇或齿落、肤燥身痒、常易外感、震颤肢麻，舌质红，脉细。

2.2衰老症状量化分级标准：参照“延缓衰老中药的筛选规程和临床观察规范中有关肾虚评分部分”^[2]制定。

重度:主动说出或显著、持续出现，为3分；中度:时重时轻，间断出现，为2分；轻度:症状较轻或偶尔出现，为1分；无症状为0分。舌脉中任何一项出现者均为3分。用治疗前后衰老积分值的变化来反映衰老程度的变化。针对衰老症状的严重程度和动态变化分级记分。

3 治疗方案

治疗组：常规治疗基础上加用参黄冲剂（江苏省中医院协定处方，江苏江阴天江制药有限公司制成中药配方颗粒），每次10?，每日3次。

对照组：常规治疗的基础上给予甲磺酸双氢麦角毒碱片（瑞士诺华制药有限公司生产），每次1mg，每日3次。

各组均连续服药8周为1个疗程，每7天复诊一次。观察时间为1个疗程。

4 疗效评价标准

根据 “中医证候的临床研究指导原则?证候疗效判定标准”^[3]，采用积分法评价中医证候疗效。

疗前积分-疗后积分

疗效指数（N）=??????????????×100%

疗前积分

①显效:症状积分下降2/3以上； N≥70%。

②有效:症状积分量降1/3-2/3；N≥30%＜70%。

③无效:未能达到上述有效标准，N＜30%。

5 观察项目及指标检测方法

5.1  观察项目

①临床指标：病史、症状、体征、舌质、脉象。

②治疗前病人随机检测P16基因的序列突变特征。

③各组治疗前后P16基因mRNA定量表达的变化。

④各组治疗前后临床疗效和症状积分。

5.2  指标检测及观察方法

5.2.1  P16基因测定  采用基因测序方法。

    ①标本收集：抽取患者静脉血2ml，试管内含抗凝剂（肝素或EDTA）

    ②模板DNA的提取：用Omega公司血液基因组DNA提取试剂盒，按说明提取DNA，应用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA纯度，再用eppendorf核酸定量仪测定DNA浓度（260nm吸光率大于0.05以上， DNA含量大于2.0ug/ul，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光率接近为0）

    ③PCR扩增:引物的设计与合成:根据NCBI相关文献提供的研究结果，确定候选的基因片段，利用genebank上提供的序列设计引物，由上海生物合成.序列为P1（上游引物）:5，GAATAAGTTACGGTCGGAG3，；P2（下游引物）：5，CGGTGACTGATGATCTAAG 3，。PCR产物片段长度401bp。

④PCR反应体系（总体系20ul）：10×PCR Buffer（含15mM MgCL2）2ul，HotStarTaq DNA Polymerase（QIAGEN公司）0.2ul，5×Q-Solution 4ul，dNTPmi×（10mM of each）2ul，Primer1 1ul，Primer2 1ul，模版DNA 1ul，Distilled water 8.8ul。

⑤PCR反应条件：置ABI-q700型扩增仪中95。C预变性15min，用TouchdownPCR，94。C变50sec，63。C-58。C退火1min（-0.5。C/1 min，72。C延伸1 min，共循环10次，94。C变性50 sec，57。C退火1 min，共循环30次，最后于72。C延伸10 min）。

PCR产物纯化：用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，根据Axygen公司提供的PCR纯化试剂盒，对PCR产物过柱纯化后，进行测序反应。

⑥测序反应:

反应体系:2.8ulBigDye＋1.6ulBigDye Seq Buffer＋0.3ul引物+1ulPCR纯化产物+6.3ulddH₂O。

测序热循环条件：96 。C，10sec→（96 。C 10sec→50 。C5 sec→60 。C4min）×25个循环→60 。C，4min→4。C保温。测序反应后纯化:每管加入1ul 125mMEDT到管底，再加入1ul 3M NaAc→每管加入100 ul 100%乙醇，封口膜封严密，震荡混匀4次，室温放置15 min→4000rpm离心45 min，马上倒置96孔→1200rpm离心1 min→重复第4步骤1次→室温挥发净酒精，加入10 ulHi-DiFormamide溶解DNA→样品在95。C变性4 min，迅速置冰中冷却4 min。

基因测序：电泳前，在数据采集软件（Datecollection2.0）中选择正确的运行模块和分析模块。样品制备，上样至3100-Avant遗传分析仪进行电泳。Datecollection软件自动进行数据处理和分析。

结果分析：将测序结果用DNA sequencing analysis5.1自动分析原始测序数据，获得测序电泳图和序列。将样品序列用DNA seqcape与标准序列进行比对，观察样本基因序列的改变。

5.2.2  P16基因mRNA表达检测

实时荧光定量PCR技术检测P16基因mRNA表达。

①提取血液中总RNA。

②总RNA的浓度及纯度鉴定。

③反转录反应：

反应体系及反应程序：Gdna 1μl, 总RNA　1.0μg，混匀，42℃孵育2min，primer 0.5μl, RTose 0.5μl , RT 10×Buffer 2μl , 加水至总体积 10μl。42℃ 30min； 95℃ 5min；-20℃ 保存。

④ Real Time反应??SYBR法：

反应体系：cDNA (RNA反转录所得cDNA) 1 µL, SYBRmix  2.5 µL，上下游primer各0.25μl, H₂O 1µL,总体积5µL。

PCR循环参数：50℃ 2 min → 95℃10 min →(92℃ 15 sec → 60℃ 1 min)×40个循环。

ABI 7900荧光定量PCR仪扩增、软件操作反应体系，分析实验数据。

6 统计分析的内容和方法

6.1 统计分析内容

研究分析衰老患者2种不同证型的P16基因的序列突变特征和mRNA定量表达的变化。研究分析中药干预后，不同证型和P16基因的关联性；中药干预后衰老患者2种不同证型P16基因mRNA表达的变化，P16基因mRNA表达变化对中药干预反应的差异。研究分析衰老患者2种证型与P16基因mRNA表达变化及P16基因型疗效关联性。研究分析中药干预后衰老2组患者的临床综合疗效。

6.2 统计分析方法

描述性统计分析，定性指标以频数表，百分率或构成比描述；定量指标以均数，标准差，或中位数，下四分位数（Q1），上四分位数（Q3），最小值，最大值描述。P16基因频率计数法，等位基因频率的比较采用X2检验。两组对比分析，定性资料采用卡方检验，Fisher精确概率法，Wilcoxon秩和检验，CMH c2检验，WLS协方差。定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验），不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验，Wilcoxon符号秩和检验；GLM协方差。 多组间比较方差分析，组间两两比较用q检验；等级资料用秩和检验。各组治疗前后比较用配对t检验。以上统计分析均SAS统计软件进行处理。

7 治疗结果

7.1 衰老患者2种不同证型的P16基因的序列特征（图1～图2）

从图1～图2中表明，肾阴虚、肾阳虚2种证型P16基因的序列特征未见明显差异。

 

7.2 衰老患者2种不同证型的P16基因mRNA定量表达的比较（图3～8）

从图3至8中表明，参黄冲剂组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）明显变大，对照组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）无明显差异。参黄冲剂组治疗后肾阴虚、肾阳虚两种证型P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）未见明显差异。

 

 

7.3 两组治疗前后衰老患者P16基因mRNA定量表达比较（表1）

表1两组治疗前后衰老患者P16基因mRNA定量表达比较（ ±S）

分组	治疗前              治疗后
参黄冲剂组 对照组	26.20±1.37◆          39.90±2.34▲ 26.57±1.59           27.97±1.90

※     治疗前两组比较p>0.05^◆，治疗后与对照组比较p<0.05^▲

由表1可以看出，参黄冲剂组与对照组在治疗前的衰老患者P16基因mRNA定量表达无统计学意义，具有可比性(p>0.05)；治疗后二组比较具有统计学意义(p<0.05)。

7.4 治疗后两组不同证型P16基因mRNA定量表达比较（表2）

表2治疗后两组不同证型P16基因mRNA定量表达比较（ ±S）

组别	参黄冲剂组	对照组
肾阴虚	（14）20.76±2.44	（12）14.24±1.60
肾阳虚	（16）19.14±1.17◆	（18）13.73±1.72◆

治疗后两组主要证型比较p>0.05^◆

由表2可以看出，治疗后两组衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚P16 基因mRNA定量表达无统计学意义(p>0.05)。

7.5 两组治疗后衰老患者临床疗效比较（表3）

表3  两组治疗后衰老患者临床疗效比较

组别	例数	显效	有效	无效	有效率（％）
参黄冲剂组	30	3	21	6	80.0▲
对照组	30	1	12	17	43.3

两组间比较p<0.05^▲

由表3可见，参黄冲剂组30例，显效3例，有效21例，无效6例，总有效率80.0％；对照组30例，显效1例，有效12例，无效17例，总有效率43.3％。经统计学处理，两组间有效率有统计学意义（p<0.01）。

    8 讨论

人体衰老是各系统生理性和病理性衰老的总和表现，同时受着诸多内外环境因素的制约，两者同时存在，相互影响，从而加速了衰老的进程。随着分子生物学迅速发展，机体内环境因素对衰老影响的科学研究日趋重视和深入，特别是衰老的主导基因p16 mRNA表达等相关内环境指标与衰老的发生发展以及机体对药物干预产生的个体反应差异受到广泛关注。

人体衰老与p16基因 mRNA表达等相关内环境指标具有密切相关性^[4]。p16基因是Serrano等^[5]利用酵母双杂交蛋白相互作用扫描技术发现的一个阳性cDNA克隆、编码分子量15 845kDa并含有4个锚蛋白(ankyrin)重复序列的蛋白质。由于该基因产物对细胞周期蛋白激酶4（CDK4）活性具有抑制作用，因而称为p16INK4(INK4，inhibitor ofCDK4)，并进一步证实了p16 INK4和CDK4相关的特异性。Kamb等^[6]利用染色体步移技术和定向测量技术，在人类染色体9p21处发现一个与p16 INK4序列完全相同的区域，命名为多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor，MTS1)。Mcconnell^[7]研究发现，细胞衰老时pl6 mRNA表达明显增高，当年轻细胞中导入pl6基因可出现衰老表型；因此认为pl6基因是细胞寿限的关键调控基因。而且，p16基因是人类细胞衰老遗传控制程序中的主要环节之一，当细胞衰老时，基因p16 mRNA表达增高，能够抑制细胞周期蛋白（cyclin）D1．CDK4的活性，使靶蛋白不能磷酸化。随着细胞分裂次数的积累，p16基因表达逐渐上调，提示p16基因水平的升高是衰老即持续性端粒缩短的原因。Jiangming等^[8]以p16基因正反义载体分别转染年轻的人成纤维细胞(2BS)，发现p16基因 mRNA过表达抑制了RB磷酸化引起细胞早衰，而其反义载体转染可以延缓细胞衰老，抑制p16基因 mRNA表达，则端粒长度缩短减慢，DNA损伤修复能力增强，而端粒酶并未被激活，从而初步阐明了p16基因mRNA表达等内环境因素影响衰老进程的机制。

本研究结果显示，衰老患者肾阴虚、肾阳虚2种证型P16基因的序列特征未见突变改变。参黄冲剂组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）明显变大（p<0.05），对照组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）无明显差异（p>0.05）。参黄冲剂组治疗后肾阴虚、肾阳虚两种证型P16基因mRNA扩增曲线起始循环数（ct值）未见明显差异（p>0.05）；参黄冲剂组与对照组在治疗前的衰老患者P16基因mRNA定量表达无统计学意义(p>0.05)，二者之间具有可比性；在治疗后两组比较具有统计学意义(p<0.05)。治疗后两组衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚P16 基因mRNA定量表达具有统计学意义(p<0.05)，这证明参黄冲剂可减少P16基因mRNA的表达，其机制可能是通过抑制衰老细胞的增殖而达到延缓衰老的作用，从而起到抗衰老的作用；但参黄冲剂对衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚基因表达无显著差异，同时本研究也证明P16基因是人类细胞衰老遗传控制程序中的主要环节之一。

本研究结果发现，两组治疗后衰老患者临床疗效比较，参黄冲剂组30例，显效3例，有效21例，无效6例，总有效率80.0％；对照组30例，显效1例，有效12例，无效17例，总有效率43.3％。经统计学处理，两组间有效率有统计学意义（p<0.01）。参黄冲剂组治疗前后两种证型症状积分比较无统计学意义（p>0.05），证明参黄冲剂对不同证型衰老患者均有疗效，可显著改善中老年患者临床症状，提高日常生活能力。

因为衰老的发生及治疗恢复是渐进漫长的过程，而不同年龄性别以及个人遗传，生活方式等诸多因素亦对疗效有不同影响，因此在今后的研究中要适当扩大样本量，延长实验时间；同时增加动物实验，以更好地选取标本探讨衰老发生演变和治疗的机制；探讨中药预防、治疗对不同证型衰老患者的疗效以及提高疗效的有效途径，包括干预时机、方式等，并从中筛选有效方剂和中药有效成分；以及用分子遗传学等方法从多角度、多手段探讨衰老及中药抗衰老的机理等，都是今后可以进一步探讨的方向。

 

参考文献

[1]朱文锋等，《中医临床诊疗术语证侯部分》，中国标准出版社，1997年，13-39．

[2]郦章安等，《现代老年药学》，中国医药科技出版社，2001年, 825-828．

[3]《中药新药临床研究指导原则》，北京：中国医药科技出版社，2002年, 378-390．

[4]何海蓉，褪黑激素的抗衰老研究进展[J]．国外医学，老年医学分册，2000，(5)．

[5]Serrano M，Hanhon GJ，Beach D．A new regulatory motify in cell cycle control cousing specific inhibition of cyclinD／CDK4．Nature，1993．366：704．707．

[6] Kamb A，Gruis NA．Weaver-Feldhaus J，et a1．A cell regulator potentially involved in genesis of many types．Science，1994，264：436-440．

[7]Mcconnel BB，Inhibitiors of cyclin-dependent kinases induces features of replicative senescent in early passage human diploid fi-broblasts．Current Biology，1998，8：351．

[8]Jiangming D，Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense p 16 ct expression．J Biol Chem，2001，276：48325-48331．

 

 

※课题项目：2008年度江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目资助方案（卫生行业内科）D类资助项目27号