ApoE基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病中医证型的相关性研究

江苏省中医院（210029）韩旭，李七一，赖仁胜，陈小虎，郭宏敏，赵惠

摘要：目的 首次应用国内最先进的基因测序技术为基础，研究冠心病（CHD）的载脂蛋白E（ApoE）基因多态性分布，探究ApoE基因多态性与CHD中医证型的相关性，为CHD中医辨证施治理论提供分子生物学依据。方法 将118例CHD患者设立为试验组，另设立123例正常人群为对照组，通过基因测序法得出：CHD组和对照组ApoE基因表型分布和等位基因频率，并进行统计学分析。结果 118例CHD患者，根据辨证分型标准，共分为以下6型：寒凝心脉证13例（占总例数的11.02%,以下同），痰浊闭阻证29 例（24.58%），心血瘀阻证33例（27.96%），心肾阴虚证11例（9.32%），气阴两虚证27例（22.88%），阳气虚衰证5例（4.24%）。CHD组E2/4、E3/4、E4/4三种基因型频率较对照组有增加的趋势，差异有统计学意义?X2=5.004，P＜0.05）；而E3/3基因型其频率较对照组则有减少的趋势，差异有高度统计学意义?X2=6.8743，P＜0.01）。CHD组ε3等位基因分布频率明显低于对照组(X2=9.2898，P＜0.05)，而ε4等位基因分布频率则明显高于对照组（X2=13.927，P＜0.01)，差异有高度统计学意义。CHD组不同中医证型ApoE等位基因频率比较，则发现：心血瘀阻证、气阴两虚证二种证型ε4等位基因频率明显高于寒凝心脉证、痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证四种证型（p<0.05）；ε3等位基因频率不同中医证型间则大致相等；ε2等位基因频率不同中医证型间心血瘀阻证较低，而寒凝心脉证、心肾阴虚证、阳气虚衰证较高。ApoE基因E4/2+E3/4+E4/4型中：痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证相互比较P＞0.05，痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证三种证型与寒凝心脉证、心肾阴虚组证、阳气虚衰证三种证型比较P <0.05。结论 CHD的主要基本证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证，并与ApoE E3/4、E4/4基因表型及ε4等位基因密切相关；ε4基因是CHD的易感等位基因，是CHD发生的重要遗传易患因素，ε3等位基因可视为CHD发生的保护因素；ApoE基因多态性、血脂水平与CHD不同中医证型之间存在因果关系，ApoE基因可通过血脂代谢作用而影响CHD的发病。江苏省中医院老年科韩旭

关键词：ApoE基因多态性；冠心病；中医证型；辨证施治

Correlative Study between apolipoprotein e(ApoE)gene polymorphism and TCM syndrome types of coronary atherosclerotic heart disease(CHD)

Abstract:

Objective：Study distribution of ApoE polymorphism in CHD by first applying the most advanced gene sequence testing technique, and to find the possibility of Traditional Chinese Medicine and Polymorphism of ApoE Gene in CHD,provding molecular biology envidences for CHD’treating of TCM.

Methods:

Make 118 CHD patients as the experient group,while another 123 healthy ones belong to the control group .Through the DNA sequencing analysis to determine ApoE phenotype distribution and allele frequency of the two groups and get the statistic analysis.

Results: 3 kinds of homozygote and 3 kinds of heterozygote of 118 CHD patients，namely E2/2、E3/3、E4/4 were detected，among most of which are ApoE gene phenotype．The genotypic frequency of E4/2，E3/4，E4/4 in experiment groups increased than those of control group?X2=5.004，P＜0.05)．The genotypic frequency of E3/3 in experiment groups decreased than those of control group?X2=6.8743，P＜0.01)．Compared with 123 samples of control group，the genotypic frequency of ε3 allele decreased significantly(X2=9.2898，P＜0.05) and which of ε4 allele increased significantly （X2=13.927，P＜0.01）． The  highly proportion of E4/2+E3/4+E4/4 genotypic frequency  in 118 CHD patients belongs to ariac blood stasis，tanzuo impotency and deficiency of both vital energy and yin(82.93%)，followed by E3/3 genotypic frequency (75.00%) and E2/2+E2/3 genotypic frequency (61.90%)of which is the lowest．The proportion of genotypic frequency in pattern of syndrome of Traditional Chinese Medicine (TCM) of ariac blood stasis，tanzuo impotency and deficiency of both vital energy and yin is significant different to that cold accumulation of heart meridian，deficiency of heart and kidney ?YIN and deficient and weak YANG QI (P <0.05)，among which the genotypic frequency of ε4 allele increased significantly andε2 withε3 is equally．Compared ApoE gen E4/2，E3/4，E4/4 pattern of syndrome of TCM of ariac blood stasis，tanzuo impotency and deficiency of both vital  energy (p>0.05),while compare that with the other three(p<0.05).

Conclusion: The main patterns of syndrome of TCM are ariac blood stasis, tanzuo impotency and deficiency of both vital energy and yin．The geneε4 allele is the susceptive allele in CHD and the important factor of genetic liability．The geneε3 allele can be a protective factor on CHD occurrence.Causality does exist among ApoE gene polymorphism,serum lipid level and different TCM patterns of CHD. Polymorphism of ApoE gene in CHD can interfere the occurrence of CHD by way of influencing metabolism of blood fat．

Key Words: Polymorphism of ApoE gene；CHD；Pattern of Syndrome of TCM,confirming treatment according to different syndromes

基金项目：江苏省自然科学基金课题（BK2006157）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）是一严重危害人类健康的疾病，随着人们对CHD认识的深入和新的临床检测客观指标和量化手段的出现，中医辨证分型客观化研究也取得了新的进展；在病证结合基础上探讨CHD中医证型与现代客观检查指标的相关性，能使中医辨证分型更加客观化和规范化，提高CHD中医辨证论治水平和临床疗效；为进一步认识及掌握CHD中医辨证规律，从而更好地发挥中医药干预这CHD的特点和优势，人们一直在试图寻找能反映CHD不同证型本质特点的现代客观检查指标[1]，我们在国内首次采用基因测序法检测了118例不同证型的CHD患者载脂蛋白E（ApoE）基因多态性，旨在探讨CHD中医辨证规律和ApoE基因多态性的相关性，现将结果报告如下 。

1 临床资料

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参照国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病命名及诊断标准》[2] 和全国中西医结合防治CHD、心绞痛、心律失常研究座谈会修订的冠心病诊断参考标准[3]。

1.1.2 中医诊断标准  参照2002年卫生部制定的《中药新药临床研究指导原则》分为：

①寒凝心脉：卒然胸痛如绞，每因受寒而诱发或加剧，甚则胸痛彻背，背痛彻心，面色苍白，形寒肢冷，出冷汗，短气心悸，舌淡苔白，脉沉迟。②痰浊闭阻：胸闷如窒而痛，或痛引肩背，气短喘促，肢体沉重，形体肥胖，痰多，纳呆恶心，舌质黯，苔浊腻，脉弦滑。③心血瘀阻：心胸疼痛较剧，如刺如绞，痛有定处，入夜更甚，日久不愈，时有心悸不宁，舌紫暗或有瘀斑，舌下静脉青紫，脉涩，或有结代。④心肾阴虚：胸痛时作，或灼痛，或兼胸闷，心悸怔忡，五心烦热，失眠多梦，盗汗，腰膝酸软，耳鸣，头晕，舌红少津，或有紫斑，脉细带数或细涩。⑤气阴两虚：胸闷胸痛，时作时止，遇劳则甚，心悸气短，动则汗出，倦怠懒言，面色少华，头晕目眩，舌质黯红或淡有齿印，脉细弱无力，或结代。⑥阳气虚衰：胸闷气短，或心痛时作，咳嗽喘息，语言低微，冷汗，畏寒肢冷，腰酸，乏力，面色苍白，重则神志昏厥，唇甲淡白或青紫，舌淡白或青紫黯，脉沉细虚数无力或沉微欲绝。

1.2 纳入标准与排除标准

1.2.1 纳入标准  ① 符合CHD西医诊断标准者。② 符合CHD中医诊断标准。③ 年龄在18－80岁之间，性别不限。   

1.2.2 排除标准  ①排除家族性高胆固醇血症，脂肪肝，糖尿病和甲状腺疾病，肾脏疾病，肝脏疾病，脑梗塞，严重高血压病等。②CHD急性心肌梗死；由其他心脏疾病、重度神经官能症、更年期症候群、甲亢、颈椎病、胆心病、胃及食管反流所致的胸痛患者。③未按规定使用了其他药物药物，影响疗效或安全性评价者。或实验期间不合作，未完成临床方案，不能评价疗效者。④因其他原因病情加重，需终止试验者。因药物不良反应停药者，纳入不良反应统计，不纳入疗效分析。⑤妊娠或哺乳期妇女，过敏体质及对药物过敏者。

1.3 研究对象  118例CHD患者全部来源于江苏省中医院心内科、老年科2006年3月至2007年12月门诊及住院患者。123例正常对照组均来自江苏省中医院体检中心。

2 观察指标及检测方法

2.1观察指标

2.1.1 一般记录项目  医院编码，受试者中文姓名及拼音首字母，性别，年龄，门诊/住院，试验开始日期。

2.1.2 观察记录项目  ①正常对照组ApoE基因表型分布和等位基因频率；②CHD组患者的中医证型及其ApoE基因表型分布和等位基因频率。

2.2 检测方法

2.2.1 采用基因测序法检测ApoE基因多态性

①标本收集：清晨抽取入选者静脉血2ml,试管内含抗凝剂（肝素或EDTA），送江苏省中医院病理科基因测序分析室。

②仪器设备：eppendorf  DNA分光光度计（定量仪） 美国ABI公司

基因测序仪3100型  美国ABI公司

2700型测序级PCR仪   美国ABI公司

Jouan BR4i型冷冻离心机  法国

凝胶自动显像仪（捷达牌）

Dy602S型电泳仪

③模板DNA的提取：用Promega公司血液基因组DNA提取试剂盒，按说明提取DNA，应用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA纯度，再用eppendorf核酸定量仪测定DNA浓度（260nm吸光率大于0.05以上，DNA含量大于2.0ug/ul，吸光率A260/A280比值1.6-1.8之间，320nm波长处吸光率接近为0）。

④PCR扩增：

引物的设计与合成：根据NCBI相关文献提供的研究结果，确定候选目的基因片段，利用genebank上提供的序列设计引物，由上海生物合成。序列为P1（上游引物）：5’AGGGTGCTG ATGGACGAGAC3’；P2（下游引物）：5’GCTCACGGATGGTGCTGAGG3’。特异性扩增ApoE基因第4外显子区含编码112与158位氨基酸的基因序列，产物片断358bp。

ApoE基因检测标准序列（358bp）：

AGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGC

GGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTG

CAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG

TACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCTCAGCGCCATCCGCGAGC

PCR反应体系（总体系20μl）：10×PCR Buffer（含15mM MgCL2）2μl,HotStarTaq DNA Polymerase（QIAGEN公司） 0.2μl, 5×Q-Solution 4μl,dNTPmix(10mM of each )2μl,Primer1 1μl ,Primer2 1μl,模板DNA 1μl,Distilled water 8.8μl。

PCR反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95℃预变性15min，用TouchdownPCR,94℃变50sec，63℃-58℃退火1min（-0.5℃/1min，72℃延伸1min，共循环10次，94℃变性50sec，57℃退火1min，72℃延伸1min，共循环30次,最后于72℃延伸10min。

PCR产物纯化：用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，根据V-GENE公司提供的PCR纯化试剂盒，对PCR产物过柱纯化后，进行测序反应。

⑤测序反应：

反应体系：1μl BigDye(2.5X)+1.5μl BigDye Seq Buffer(5X)+ 3μl引物+1μl PCR纯化产物+3.5μl ddH2O。

测序热循环条件：96℃，10sec→(96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min) ×25个循环→60℃，4min→4℃保温。

测序反应后纯化：每管加入1μl 125 mMEDT到管底，再加入1μl 3M NaAc→每管加入25μl 100%酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15min→1600xg离心45min，马上倒置96孔ABI板，离心至185xg停止离心→每管加入35μl 75%酒精，1650xg4℃离心15min(JOUANBR4i)；马上倒置96孔板，离心至185xg停止离心→重复第4步骤1次→室温挥发净酒精，加入10μl Hi-DiFormamide溶解DNA→样品在95℃变性4min,迅速置冰中冷却4min。

基因测序：电泳前，在数据采集（Datecollection2.0）软件中选择正确的运行模块和分析模块。

样品制备：上样至3100-Avant遗传分析仪进行电泳。

Datecollection软件自动进行数据处理和分析。

⑥结果分析：将测序结果用DNA sequencing analysis 5.1自动分析原始测序数据，获得测序电泳图和序列。将样品序列用DNA star seqman与标准序列进行比对，观察样本基因序列的多态性改变。

2.2.2 血脂指标检测  所有入选者于清晨抽取空腹静脉血2ml送江苏省中医院检验科，以全自动生化分析仪检测血总胆固醇（TC）、三酸甘油酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等指标。

3 统计分析方法  描述性统计分析，定性指标以频数表，百分率或构成比描述；定量指标以均数，标准差描述。两组对比分析，定性资料采用卡方检验，Fisher精确概率法，Wilcoxon秩和检验，CMH c2检验。定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验），不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验，Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验，给出检验统计量及其对应的P值。以P≤0.05作为有统计学意义，以P≤0.01作为有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。

4 结果

4.1 正常对照组与CHD组ApoE基因表型分布比较

118例CHD患者共检出E2/2、E3/3、E4/4三种纯合子和E2/3、E2/4、E3/4三种杂合子（见图1），以E3/3纯合子占大多数，E2/2纯合子最低，与文献报导的大体一致[4]。而且，CHD组携带的E2/4、E3/4、E4/4三种基因型频率较对照组有增加的趋势，差异有统计学意义(X2=5.004，P＜0.05)；而E3/3基因型其频率较对照组则有减少的趋势，差异有高度统计学意义(X2=6.8743，P＜0.01) ，见表1。  

表1 正常对照组与CHD组ApoE基因表型分布比较

组别    例数  E2/2（%） E2/3（%）  E3/3（%） E2/4（%） E3/4（%）  E4/4（%）

CHD组   118   5（4.24） 16（13.56） 56（47.45） 8（6.78）  17（14.41） 16（13.56）

对照组    123   8（6.51） 11（8.94）  79（64.23） 7（5.69）  11（8.94）  7（5.69）

4.2 正常对照组与CHD组ApoE等位基因分布频率比较

123例正常对照组中，等位基因分布频率则以ε3最高，占到74.39%，与文献报导的大体一致[4]。CHD组ε3等位基因分布频率明显低于对照组(X2=9.2898，P＜0.05)，而ε4等位基因分布频率则明显高于对照组（X2=13.927，P＜0.01），差异有高度统计学意义，见表2。

表2 正常对照组与CHD组ApoE等位基因分布频率比较

组别       例数         ε2（%）         ε3（%）              ε4（%）

CHD组      118          34（14.41）      145（61.44）           57（24.15）

对照组       123          37（15.04）      183（74.39）           26（10.57）

4.3 CHD组的中医辨证分型

118例入选的CHD患者，根据上述辨证分型标准，共分为以下6型：寒凝心脉证13例（占总例数的11.02%,以下同），痰浊闭阻证29 例（24.58%），心血瘀阻证33例（27.96%），心肾阴虚证11例（9.32%），气阴两虚证27例（22.88%），阳气虚衰证5例（4.24%），各证型所占比例与多数作者的研究结果基本一致[5-7] ，见表3。

表3  CHD组的中医辨证分型表

证   型                       例数                  百分比（%）

寒凝心脉                        13                      11.02

痰浊闭阻                        29                      24.58

心血瘀阻                        33                      27.96

心肾阴虚                        11                      9.32

气阴两虚                        27                      22.88

阳气虚衰                        5                       4.24

合    计                        118                     100

4.4 CHD组不同中医证型的ApoE基因表型分布比较

118例入选的CHD患者不同中医证型检出的基因表型比例不一，且某些中医证型样本含量很小，故未对全部中医证型的ApoE基因表型分布情况进行统计学分析；但从表4中可以看出：5例E2/2基因表型中仅见2例寒凝心脉证，痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证各1例；16例E2/3基因表型中以心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证为主，占该基因表型的75.0%；56例E3/3基因表型中心肾阴虚证、阳气虚衰证最少，仅占该基因表型的14.28%，而心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证最多，占75.00%；E3/4基因表型中心血瘀阻证、气阴两虚证比例相对较高，占该基因表型的52.94%；E4/4基因表型中也以心血瘀阻证和气阴两虚证为多，分别占该基因型的50.00%和43.75%。

表4  CHD组不同中医证型的ApoE基因表型分布比较一

证型      例数  E2/2（%） E2/3（%） E3/3（%）  E2/4（%）  E3/4（%）  E4/4（%）

寒凝心脉    13    2(15.39)   1(7.69)     6(46.15)     1(7.69)      2(15.39)    1(7.69)

痰浊闭阻    29    1(3.45)    4(13.79)    17(58.62)    3(10.34)     3(10.34)    1(3.45)

心血瘀阻    33    0(0.00)    4(12.12)    15(45.46)    1(3.03)      5(15.15)    8(24.24）

心肾阴虚    11    1(9.09)    2(18.18)    5（45.46）  1(9.09)      1(9.09)     1(9.09)

气阴两虚    27    0(0.00)    4(14.82)    10(37.04)    2(7.40)      4(14.82)    7(25.92)

阳气虚衰    5     1(20.00)   1(20.00)    3(60.00)     0(0.00)      0(0.00)     0(0.00)

合  计     118    5(4.24)    16(13.56)   56(47.46)    8(6.78)      15(12.71)   18(15.25)

注：括号内为各基因型所占该证型总例数的%。

参照国内外文献常将意义相近的基因表型合并分析的情况，我们也将E2/2基因表型和E2/3基因表型合并，E2/4、E3/4基因表型和E4/4基因表型合并，再与E3/3基因表型一起进行分析，结果表明：CHD组E4/2+E3/4+E4/4型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例最高，为82.93%；其次是E3/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为75.00%；最低是E2/2+E2/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为61.90%；其余各证由于例数较少，未予比较。经统计学分析可以看出，E4/2+E3/4+E4/4型中：痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证相互比较P＞0.05，痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证三种证型与寒凝心脉证、心肾阴虚组证、阳气虚衰证三种证型比较P <0.05，说明CHD的主要证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证，见表5。

 

 

 

 

 

 

表5  CHD组不同中医证型的ApoE基因表型分布比较二

   证型       例数     E2/2+E2/3（%）    E3/3（%）      E2/4+E3/4+E4/4（%）

寒凝心脉    13         3(23.08)         6(46.15)           4(30.77)   

痰浊闭阻    29         5(17.24)         17(58.62)          7(24.14)    

心血瘀阻    33         4(12.12)         15(45.46)          14(42.42)    

心肾阴虚    11         3(27.27)         5（45.46）         3(27.27)     

气阴两虚    27         4(14.81)        10 (37.04)          13(48.15)    

阳气虚衰    5          2(40.00)         3(60.00)           0(0.00)

合    计    118        21(17.79)       56(47.46)           41(34.75)

注：括号内为所分析的基因型占该证型总例数的%。 

4.5 CHD组不同中医证型的ApoE等位基因频率比较

通过对CHD组不同中医证型ApoE等位基因频率比较，我们发现：心血瘀阻证、气阴两虚证二种证型ε4等位基因频率明显高于寒凝心脉证、痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证四种证型（p<0.05）；ε3等位基因频率则不同中医证型间大致相等；ε2等位基因频率不同中医证型间心血瘀阻证较低，而寒凝心脉证、心肾阴虚证、阳气虚衰证较高；产生上述不同的原因，可能与我们观察的病例数以及病人来源和本地CHD发病原因有关，见表6。

表6  CHD组不同中医证型的ApoE等位基因频率比较

   证型        例数       ε2（%）           ε3（%）               ε4（%）

寒凝心脉      13        6（23.08）         15（57.69）            5（19.23）    

痰浊闭阻      29        9（15.52）         41（70.69）            8（13.79）         

心血瘀阻      33        5（7.58）          39（59.09）            22（33.33）     

心肾阴虚      11        5（22.73）         13（59.09）            4（18.18）   

气阴两虚      27        6（11.11）         28（51.85）            20（37.04）    

阳气虚衰      5         3（30.00）         7 （70.00）            0（0.00）

合    计     118        34（14.41）        143（60.59）           59（25.00）

注：括号内为各等位基因所占该证型的%。

5 讨论

5.1 ApoE基因多态性与CHD的相关性

由于ApoE是血液中最主要的载脂蛋白成分之一，ApoE基因多态性与血脂代谢又具有密切的关系，而血脂异常是CHD主要的危险因素，因此ApoE基因多态性与CHD的关系成为研究的主要热点之一。已有学者发现[8]，CHD组ε4等位基因频率高于对照组，因此推测ε4等位基因是CHD发病的遗传标记。Lehtinen等[9]对309例经冠脉造影诊断的CHD患者研究发现，心肌梗死发生率的高低顺序为E4/4>E3/4>E3/3>E2/3，且ε4等位基因与CHD病变的严重程度具有相关性。1996年Wilson等[10]的研究也表明，ApoE等位基因与冠状动脉缺血事件的危险性密切相关，尸检结果提示ApoE基因型与冠状动脉病变范围有关。Kuusi等[11]在芬兰人群中经冠脉造影证实的CHD患者ε4等位基因频率明显升高，并提出ε4等位基因的增加可增加CHD的易感性。Corbo等[12]的研究更进一步指出，ε4等位基因基于它具有的一些功能性和在人群中的分布，被称作“thrifty”等位基因，在当代环境条件（西方化饮食、平均寿命延长等）下，ε4基因的暴露被认为是CHD和动脉硬化的易感等位基因。近年来国内也有大量研究探讨了在中国人群中ApoE基因多态性与CHD的关系，李氏等[13]应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测了125例老年CHD患者和116例健康老年人的ApoE基因型，结果表明CHD组E3/3基因频率(51.2%)和ε3等位基因频率（73.2%）明显低于对照组(69.8%和84.0%,p<0.05)；E3/4基因频率（30.4%）和ε4等位基因频率(17.6%)明显高于对照组(11.2%和6.9%，p<0.05)。杨氏等[14]研究了新疆乌鲁木齐地区维汉两民族CHD患者与ApoE基因多态性的关系，共观察了103例维汉族CHD患者和54例正常对照人群（心绞痛患者和大部分心肌梗死患者均经冠脉造影证实），采用PCR-RFLP方法，结果表明：（1）维族中ApoE之ε2、ε3和ε4等位基因频率分别为0.221±0.373,0.647±0.380和0.132±0.224与汉族(0.081±0.196,0.772±0.315和0.146±0.237)比较，ε2明显增高（p<0.05），ε3和ε4虽有减低，但无统计学意义（p>0.05）；（2）ApoE之ε2、ε3和ε4等位基因频率在CHD分别为0.073±0.215,0.777±0.311和0.151±0.241，与对照组（0.185±0.296,0.685±0.367和0.130±0.221）比较，ε2明显减低（p<0.05），维族中更明显（0.105±0.315对0.367±0.296，p<0.05），ε3和ε4虽有升高但无统计学意义（p>0.05）。ε2缺失与CHD其它危险因子一起作Logistic回归分析，ε2缺失（危险比RR=3.45，p<0.05）为CHD的危险因子之一。从而得出以下结论：在新疆乌鲁木齐地区维汉两民族人群中，维族和汉族人群中ApoE基因型分布有高度统计学意义（p<0.01），维族人群中ε2等位基因频率明显高于汉族；CHD患者ApoE基因之ε2等位基因明显降低，其中维族更明显，ε3和ε4有所升高；ApoE基因多态性（ε2等位基因缺失）为CHD的危险因子之一，亦即ε2与冠心病负相关。杨氏等[15]同时研究了CHD病变范围与ApoE基因多态性的关系，结果：CHD组ApoE之ε2、ε3和ε4等位基因频率分别为0.0735±0.2157,0.7745±0.3117和0.1520±0.2416，单支病变组ApoE之ε2、ε3和ε4等位基因频率分别为0.1061±0.2423,0.7576±0.3562和0.1364±0.2261，2支病变组ApoE之ε2、ε3和ε4等位基因频率分别为0.0556±0.1992,0.8056±0.2995和0.1389±0.2567，3支病变组ApoE之ε2、ε3和ε4等位基因频率分别为0.0606±0.2076,0.7576±0.2829和0.1818±0.2443，与正常对照组（0.1961±0.3013,0.6667±0.3697和0.1373±0.2254）比较，ε2明显减低（p<0.05），病变范围越大，ε2越低，但病变范围大小之间统计学无差异，ε3和ε4随着病变范围增大逐渐升高，但无统计学意义（p>0.05）。彭氏等[16]研究了ApoE基因多态性对心肌梗死发生、发展及预后的作用，他们共观察了104例心肌梗死患者和180健康对照者ApoE基因多态性，结果表明：心肌梗死组ApoE3/4型和ε4等位基因频率均显著高于对照组（p<0.05），通过计算OR值显示，ε4等位基因与心肌梗死发病存在密切关联[OR（95%CI）=1.91（1.43～2.39），p<0.01]；心肌梗死组泵功能Ⅲ－Ⅳ级患者E4/E3基因型频率高于泵功能Ⅰ－Ⅱ级患者，说明ε4等位基因为心肌梗死的一种重要遗传标志，它为心肌梗死与CHD的病因学研究提供了新的线索。除了上述研究CHD患者ApoE基因多态性的特点外，也有些研究探讨了CHD患者子代或同胞ApoE基因多态性与正常人群的差异性，赵氏等[17]检测了63例具有早发CHD家族史的同胞和49例年龄、性别相匹配的健康对照者的ApoE基因型，结果未发现在ApoE基因型频率和等位基因频率分布上存在统计学意义。但李氏等[18]的研究却得出不同结果，他们通过对152例健康汉族大学生在问卷调查的基础上，根据一、二级亲属有无CHD病史分为阳性组与对照组，采用PCR-RFLP方法进行了ApoE基因多态性检测，结果有CHD家族史的阳性组ε4等位基因频率显著高于无CHD家族史的对照组，从而认为ε4可能是CHD的重要遗传因子。陈氏等[19]检测了65例心肌梗死患者及141例其健康一级同性同胞的ApoE基因多态性，并与47例健康对照者进行了比较，结果发现心肌梗死患者及其一级同胞ε4等位基因携带有增高趋势，提示ApoE基因多态性可能是促使CHD和心肌梗死发生的遗传因素。廖氏等[20]进行了ApoE基因多态性与多因素作用致CHD的研究，经多因素Logistic回归结果显示，高血压史、高血脂史、肺炎衣原体（Cpn）感染、巨细胞病毒（CMV）感染和ApoE基因多态性为CHD的危险因素，比值比OR分别为5.04，3.64，2.37，3.51，3.33。ApoE基因多态性与高血压史、高血脂史、Cpn感染、CMV感染间交互作用指数分别为1.73，1.55，1.28，1.20，归因交互百分比分别为40.64%，33.25%，19.01%和15.15%，从而得出结论：高血压史、高血脂史、Cpn感染、CMV感染和ApoE基因多态性可能是CHD的主要危险因素，且ApoE基因多态性与其它危险因素在致CHD的关系中存在正交互作用。

与上述研究结论不同的是，也有个别报道ApoE基因多态性在CHD组和正常人群间比较无统计学意义，如张氏等[21]通过检测96例CHD患者和131例健康对照者ApoE基因多态性，结果表明：E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4基因型在两组的频率分别是0、11.5%、3.1%、69.8%、14.6%、1.0%和1.5%、12.2%、0、69.5%、16.0%、0.8%，ε2、ε3和ε4等位基因频率分别是7.3%、82.8%、9.9%和7.6%、83.6%、8.8%，两组间比较均无统计学意义。

本课题的研究证实：由表3－1和表3－2中可见，CHD组携带的E4/2、E3/4、E4/4三种基因型频率较对照组有增加的趋势，差异有统计学意义（X2=5.004，P＜0.05）；而E3/3基因型其频率较对照组则有减少的趋势，差异有高度统计学意义(X2=6.8743，P＜0.01)；比较CHD组与对照组等位基因分布频率时，则发现：CHD组ε3等位基因分布频率明显低于对照组(X2=9.2898，P＜0.05)，而ε4等位基因分布频率则明显高于对照组（X2=13.927，P＜0.01），差异有高度统计学意义；提示ε4基因是CHD的易感等位基因。

综上所述，我们的研究显示：ε4等位基因是CHD发生的重要遗传易患因素，并可能与CHD患者心脏事件的的发生、发展和预后密切相关；ε3等位基因可视为CHD发生的保护基因，与以往的观察结果基本一致。但是，本研究首次采用国内最先进的基因测序法，直接检测CHD患者的ApoE基因多态性，与其他带有抽样性质的PCR-sscp，高效液相等粗筛方法最大的不同是：它是对未知的ApoE第4外显子全基因组片段进行逐个碱基的分析，不仅能精确发现ApoE六种不同的多态性，还能发现该六种多态以外的未知杂合子，多态和罕见型。另外还具有验证上述全部电泳条带可能出现的误差，漏检情况，国外的文献已经肯定基因测序方法检测DNA序列是分子生物学领域的金标准；本研究结果为CHD患者的ApoE基因多态性提供了更精确、更可靠的实验数据。因此在人群中进行ApoE基因多态性检测，对CHD的早期预防、监测和积极的干预均有较为重要的意义。

5.2 ApoE基因多态性与CHD中医证型的相关性

宋氏[22]认为中医证候多样性及发生频率与特定基因多态性存在某种关联,此关联可能是证候形成与体质类型或先天禀赋差异的分子基础。研究表明：不同ApoE基因型临床血脂改变谱、某些心脑血管病的发生特点等存在差异，而中医高脂血症实质研究也提示不同证型间在血脂指标、血液流变学指标等方面存在差异，因此设想[23]ApoE的基因型可以作为高脂血症中医辨证特点的依据。蒋氏[24]的研究通过对102例高脂血症患者进行中医辨证分型及ApoE基因多态性的检测分析，初步发现两者之间存在一定的关系。统计学分析表明，肝肾阴虚证的E3/4和E4/4型明显高于脾肾阳虚证和痰浊阻遏证（p<0.05），气滞血瘀证E3/4和E4/4型明显高于痰浊阻遏证（p<0.05）；而对ApoE等位基因频率比较发现，肝肾阴虚证ε4等位基因频率明显高于脾肾阳虚证和痰浊阻遏证（p<0.05~0.01），气滞血瘀证ε4等位基因频率明显高于痰浊阻遏证（p<0.05）。

以往的证候研究已证实，ApoEε4等位基因的携带者更易于发生脂质代谢紊乱， 而痰浊、血瘀又与脂质代谢紊乱密切相关[25]，与脂质代谢紊乱相关的ApoE基因多态性可能是影响CHD “痰”的发生和发展的遗传基础；欧氏等[26]的研究结果表明：ApoE第4外显子的基因型及等位基因频率在CHD不同中医证候中的分布有明显差异，变异等位基因ε4的携带者TC和LDL-C明显升高，更倾向于发生痰证，表明ε4等位基因，特别是E3/4基因型可能是CHD及中医痰证的主要易感基因之一。因此，密切关注ε4等位基因，特别是E3/4基因型携带者的血脂水平，保持合理的饮食结构和生活方式将有利于防止或延缓CHD的发生和发展。

本课题的研究发现：118例入选的CHD患者，根据CHD中医辨证分型标准，共分为以下6型：寒凝心脉证13例（占总例数的11.02%,以下同），痰浊闭阻证29 例（24.58%），心血瘀阻证33例（27.96%），心肾阴虚证11例（9.32%），气阴两虚证27例（22.88%），阳气虚衰证5例（4.24%），其中最多见的是心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证。基因型分布在E3/4基因表型中心血瘀阻证、气阴两虚证比例相对较高，占该基因表型的52.94%；E4/4基因表型中也以心血瘀阻证和气阴两虚证为多，分别占该基因型的50.00%和43.75%；参照国内外文献常将意义相近的基因表型合并分析的情况，我们也将E2/2基因表型和E2/3基因表型合并，E2/4、E3/4基因表型和E4/4基因表型合并，再与E3/3基因表型一起进行分析，结果表明：CHD组E4/2+E3/4+E4/4型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例最高，为82.93%；其次是E3/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为75.00%；最低是E2/2+E2/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为61.90%；其余各证由于例数较少，未予比较；经统计学分析可以看出，E4/2+E3/4+E4/4型中：痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证相互比较P＞0.05，痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证三种证型与寒凝心脉证、心肾阴虚组证、阳气虚衰证三种证型比较P <0.05，说明CHD的主要证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证。通过对CHD组不同中医证型ApoE等位基因频率比较，我们发现：心血瘀阻证、气阴两虚证二种证型ε4等位基因频率明显高于寒凝心脉证、痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证四种证型（p<0.05）；产生上述不同的原因，可能与我们观察的病例数以及病人来源和本地CHD发病原因有关。据此我们认为CHD的主要基本证型心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证与E3/4、E4/4基因表型及ε4等位基因密切相关。

5.3 问题与展望

综上所述，本研究发现CHD患者ε3等位基因分布频率明显低于对照组，而ε4等位基因分布频率则明显高于对照组，差异有统计学意义；提示ε4等位基因是CHD发生的重要遗传易患因素，与CHD患者心脏事件的发生、发展和预后密切相关；ε3等位基因则为CHD发生的保护因素。由于以上研究的病例来源均为江苏藉汉族人，故本研究结果为江苏藉汉族CHD患者的 ApoE基因多态性与中医的辨证分型相关性提供了可靠的数据；但是，我国幅源辽阔、民族众多、地域差别较大，因此进一步进行不同地域、不同民族、大样本量、多中心的研究，期望得到全国CHD与ApoE基因多态性遗传病因学的全面资料，同时加大ApoE基因多态性与中医的辨证分型相关性研究力度，对CHD的早期预防、监测和积极的干预均有较为重要的意义。

本研究还证实了CHD患者的基本证型心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证与E3/4、E4/4基因表型及ε4等位基因之间密切相关。由此设想是否可以根据ApoE基因多态性作为CHD中医辨证分型标准，确定CHD的基本证型？不同的ApoE基因表型对CHD中医辨证施治是否具有指导价值？中医治疗能否影响到CHD患者ApoE基因的表达？这都是我们要进一步研究的重点，以便更清晰地揭示出ApoE基因多态性与CHD中医辨证施治的关系。

 

 

 

 

 

 

 

 

图1  ApoE基因表型图及测序图

Graph1　 Electropherograms and sequence spectrums of different genotype sequencing in ApoE

 

E2/2基因型　112位氨基酸：TGC（Cys），158位氨基酸：TGC（Cys）  

158位
 
112位
 
　

 

E2/3基因型　112位氨基酸：TGC（Cys），158位氨基酸：CGC（Arg）/ TGC（Cys）

158位
 
112位
 
　

 

E3/3基因型　112位氨基酸：TGC（Cys），158位氨基酸：CGC（Arg）

158位
 
112位
 
  

 

E2/4基因型　112位氨基酸：TGC（Cys）/ CGC（Arg），158位氨基酸：TGC（Cys）/ CGC（Arg）

158位
 
112位
 
　

 

E3/4基因型　112位氨基酸：TGC（Cys 半胱氨酸）/CGC（Arg　精氨酸），158位氨基酸：CGC（Arg）

112位

T/C杂合
 
158位
 
　 　

 

E4/4基因型　112位氨基酸：CGC（Arg），158位氨基酸：CGC（Arg）

112位
 
158位
 

 

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