Ku70在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及意义

摘 要： 目的 探讨ku70在在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及临床意义。方法 免疫组化方法检测20例正常卵巢、100例卵巢浆液性肿瘤（卵巢浆液性囊腺瘤30例、卵巢交界性浆液性囊腺瘤20例和卵巢浆液性囊腺癌50例）组织中ku70的表达，分析其表达与临床病理参数之间的相关性。结果 ku70在正常卵巢组织、良性、交界性和恶性卵巢浆液性组织中都有不同程度的表达，且在交界性和恶性卵巢浆液性组织中ku70的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢囊腺瘤(p＜0.01)，卵巢癌组织分化程度越差ku70的阳性率越高，表达强度亦越强，与肿瘤的临床分期、腹水、淋巴结转移均相关(p＜0.05)。结论 ku70的异常表达和卵巢浆液性肿瘤恶变相关。山东大学齐鲁医院妇科张师前

关键词 卵巢肿瘤；免疫组化；ku70蛋白

   卵巢上皮癌目前是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是多因素多基因共同作用的结果。现在，针对卵巢癌的基因研究已开始应用于卵巢肿瘤的分类、早期诊断、治疗以及预测肿瘤转移复发等方面。与肿瘤相关的参与dna双链断裂修复（dna double-strand-break repair, dsbr）的重要分子ku70蛋白国内外已做了大量研究，是近年发现的重要修复调控因子，参与dna双链断裂末端的识别^[1]，其与肿瘤的发生、浸润和转移关系密切^[2]。然而，ku70在卵巢肿瘤方面的研究仍然少见报道。卵巢肿瘤中尤以浆液性肿瘤为多见, 本研究通过检测ku70在正常卵巢、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢交界性浆液性囊腺瘤和卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达，旨在探讨ku70在卵巢癌发生发展过程中的意义。

1资料与方法

1．1 研究对象   选择山东大学齐鲁医院妇科2003年1月至2010年1月行手术切除石蜡包埋的100例卵巢浆液性肿瘤组织标本，其中浆液性囊腺瘤30例、交界性浆液性囊腺瘤20例、浆液性囊腺癌50例为研究组；取自同期患卵巢囊肿 

 

、子宫肌瘤、功能性子宫出血者的非癌卵巢组织20例为对照组。所有病例术前均根据诊治方案，并在患者知情同意下未行骨盆放射及全身局部化疗。均经病理确诊。年龄18~75岁。采用2000年修订的国际妇产科协会（figo）临床分期标准分期，50例卵巢浆液性囊腺癌中?期3例、?期18例、? 期 17例、?期12例；其中19例有淋巴结转移；35例有腹水，组织分化程度：g₁ 18例，g₂ 20例，g₃ 12例。

1．2免疫组化染色 石蜡切片厚度4um，常规脱蜡至水, 采用高压煮沸法行抗原修复后按sp试剂盒 (北京中杉生物技术有限公司)提供的说明书进行。兔抗ku70多克隆抗体为（北京中杉生物技术有限公司）提供。工作浓度1：300，dab显色，苏木素对比染色。每批切片免疫组化染色分析均以已知阳性组织切片做阳性对照，以pbs缓冲液代替一抗做阴性对照。

1．3判定标准  随机选择5个高倍视野，计数500个以上细胞。均以胞核着色判断为阳性,根据阳性细胞数及细胞染色强度进行半定量^[3]:无阳性细胞,计0分；阳性细胞数1%～30%,计1分,31%～70%计2分,71%～100%计3分。再根据阳性着色强度依次计0、1、2、3分。 不着色为0分,浅棕色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。每张切片的两项分数累计,0分为阴性，1～2分为弱阳性+，3～4分为中阳性++，5～6分为强阳性+++，弱阳性归为阴性组。

1．4统计学处理   采用spss17.0软件包处理数据，进行卡方检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1  ku70在正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢交界性浆液性囊腺瘤和卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达 见图1. ku70在正常卵巢组织中呈阴性表达（图1a）。卵巢浆液性囊腺瘤阳性率30%（9/30），其中中阳性占30%（图1b），无强阳性表达。卵巢交界性浆液性囊腺瘤阳性率55%（11/20）(图1c)，其中中阳性占20%，强阳性占35%，卵巢浆液性囊腺癌阳性率占86%（43/50）（图1d），其中中阳性占30%，强阳性占56% 。卵巢浆液性肿瘤从良性 、交界性到恶性ku70表达逐渐增强，差异有统计学意义 (p＜0.01)，见表1。

表1ku70在正常卵巢组织、卵巢上皮性肿瘤组织中的表达

       组别                    例数              ku70  表达情况          

                                            -/+         ++           +++                                                                                                                           

 正常卵巢组织           20       20(100%)   0(0%)         0(0%)

      浆液性囊腺瘤            30       21(70%)    9(30%)        0(0%)

      交界性浆液性囊腺瘤          20        9(45%)      4(20%)          7(35%）

   浆液性囊腺癌 *             50        7(14%)      15(30%) *       28(56%) *

 

* p<0.01(表达率) vs 正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤及交界性浆液性囊腺瘤

 

图1 ku70在正常卵巢及浆液性卵巢肿瘤组织中的表达

 a 正常卵巢组织ku70阴性(sp×400) b浆液性囊腺瘤ku70阳性(sp×400) c卵巢交界性浆液性囊腺瘤ku70阳性 (sp×400)  d卵巢浆液性囊腺癌ku70阳性(sp×400)

fig.1　expression of ku70  in normal ovarian tissues and serous ovarian tumors

     a: expression of ku70 in normal human ovarian tissues; b: expression of ku70 in ovarian serous cystadenoma; c:expression of ku70 in ovarian borderline serous cystadenoma ; d:expression of ku70 in ovarian serous cystadenocarcinoma .

2．.2  ku70表达与卵巢浆液性囊腺癌临床病理特征关系  见表2  由表2可见ku70的表达与卵巢浆液性囊腺癌的组织学分级、临床分期、腹水及淋巴结转移关系密切(p＜0.05)。

表2 ku70表达与卵巢癌临床病理特征的关系

 

临床病理特征	例数n	ku70阳性率（％）	p值
组织分化
高分化	18	66.7	＜0.05
中低分化	32	96.9
临床分期
?-?	21	71.4	＜0.05
?-?	29	93.1
腹水
无	15	60.0	＜0.05
有	35	97.1
淋巴结转移
无	31	77.4	＜0.05
有	19	100

 

3 讨 论

研究表明，dna损伤修复功能缺陷者易患各种恶性肿瘤，其修复机制在保护基因组的稳定进而抑制肿瘤发生和进展方面起着重要作用。dsbr是目前dna修复的主要方式之一，而非同源末端连接（non-homologous,end joining, nhej）是人和哺乳动物细胞dsbr的重要通路^[4]  。nhej主要由dna依赖蛋白激酶（dna-dependent protein kinase, dna-pk）分子构成，而dna-pk是由催化亚基dna-pkcs和两个辅助因子ku70和ku80组成的异二聚体的全酶^[5]，是nhej的关键酶。ku蛋白通过调控dna-pk的活性参与dna损伤导致的双链dna断裂（double．strand breaks，dsbs）的修复。在nhej中它最早感应并结合到dna双链断裂末端，与双链dna末端有极高的亲和力^[6]。避免dna不被核酸酶降解，以确保遗传信息不被丢失，从而维持基因组的稳定而预防癌症的发生。ku 蛋白广泛存在于哺乳动物细胞内，由 70kda 和 80kda 两条多肽链组成，分别被称之为 ku70 和 ku80。人ku70基因位于22q13，编码609个氨基酸，相对分子质量约69 000。ku70蛋白的功能具有多样性，在dna复制、基因转录调控和端粒结构的维持等多种细胞活动中均发挥着重要作用，特别是作为dna断裂修复重要因子在肿瘤的形成和发展过程中的作用越来越被人们所重视。研究者们通过免疫组化和免疫印迹实验等检测了ku70在人各种正常和恶性组织中的分布，发现不同类组织细胞ku70含量也各异。有研究已表明ku70在直肠腺瘤和直肠癌中的表达不同，结果提示直肠癌组织中ku70的表达明显高于直肠粘膜^[7]。宫颈癌组织中ku70的表达明显高于正常宫颈组织和宫颈内瘤变^[8]。

本研究结果显示，正常卵巢组织中ku70表达缺失，良性肿瘤中低表达，在交界性及恶性肿瘤中逐步呈高表达，良恶性比较有显著性差异。提示随着肿瘤细胞的加速增殖、转化或恶性变，ku70表达增高，进而提示ku70与细胞的恶变相关，说明ku70可作为鉴别良恶性肿瘤有价值的参考指标，有可能成为卵巢癌新的肿瘤标志物。另外本研究显示了ku70的表达与卵巢癌的临床病理特征的关系，其表达与肿瘤的病理分级、临床分期、腹水形成和淋巴结转移相关(p＜0.05)，表明 ku70 的表达与卵巢浆液性囊腺癌的发生发展、恶性程度、肿瘤细胞的增殖及侵袭转移有着密切关系。由于临床分期影响着卵巢癌的预后，可以认为ku70的表达可能对肿瘤患者的预后具有较为重要的临床意义，此与economopoulou ^[9]及boldogh等^[10]的报道相一致。pucci等^[11]对膀胱癌和乳腺癌病人的癌组织中ku的dna结合活性进行的研究表明，ku70/ku80的dna结合活性的调控与肿瘤的进展相关，其异常表达与肿瘤的恶性行为有关，此与本研究结果相符。本研究显示了在卵巢浆液性恶性肿瘤中ku70的表达易达到高水平，可用免疫学方法测定，这为临床应用ku70诊断、预防和治疗卵巢浆液性肿瘤提供有效的理论依据。近年来，基础研究发现了和ku有关的抗肿瘤药物的敏感性以及肿瘤放射增敏机制。kim 等^[12]的研究发现ku蛋白和 dna - pk复合物的表达水平在接受博来霉素、阿糖胞苷和长春新碱治疗后均有所下调 ，提示 ku蛋白影响着抗癌药物对肿瘤细胞的敏感性，并且下调ku70的表达可增加卵巢癌细胞对顺铂、足叶乙苷及苯丁酸氮芥的敏感性^[13]，在对早期乳腺癌的治疗中，低表达的ku70对放疗有更好的治疗效果^[14]，提示ku70在卵巢癌耐药的发生及放射增敏中可能起着重要作用。因此，进一步的临床及实验研究可能表明肿瘤细胞dna修复基因过度表达，将会对基因毒性抗癌药产生耐受，降低了放射治疗敏感性，给肿瘤的治疗造成困难，影响患者的预后。以ku为靶点的dna修复抑制剂，有望成为肿瘤治疗的新靶点。

总之，ku70在肿瘤的形成和发展过程中的作用是复杂多样的，在正常细胞向肿瘤细胞转化过程中其修复能力的降低可能是基因组不稳定的因素之一，而在恶性肿瘤组织中ku70的高表达又可能与正常细胞修复失活、肿瘤细胞的无限增殖有关。本研究结果显示了ku70与卵巢癌的发生发展有关，提示ku70是一种有潜力的肿瘤标记物，并且在预后评价中具有潜在的临床应用价值，有可能成为卵巢癌治疗的潜在靶点。下调该基因活性可抑制癌基因或修复缺陷基因，抑制肿瘤细胞生长，但不影响正常细胞。虽然其作用的途径和机制并不清楚，但已表明它在肿瘤的发生、发展中的重要性，可能为卵巢癌的预防和治疗提供新的方向。