血管瘤中缺氧诱导因子－1α的表达和血管形成的研究

陈达¹  林晓曦2  吴溯帆¹ 

1 浙江省人民医院 整形外科 310014

2 上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科 200011浙江省人民医院整形外科吴溯帆

 

【摘要】  目的 探讨血管瘤中缺氧诱导因子－1α在血管瘤中的表达以及其和血管内皮细胞生长因子、新生微血管密度（MVD）的关系。 方法 采用免疫组化SP法检测28例婴幼儿血管瘤中HIF-1α、VEGF的表达和MVD。 结果 28例血管瘤中HIF-1α、VEGF阳性率分别是64%,71.4%,其中增生期和消退期HIF-1α阳性率分别为87.5%、33.3%（P<0.01）;VEGF阳性率分别为93.7%,41.7%( P<0.01)；MVD为73.4±14.63,30.2±9.1(P<0.01)。HIF-1α蛋白表达与VEGF成正相关( P<0.01)，HIF-1α和VEGF与MVD都成正相关( P<0.01)。 结论 血管瘤增生期血管内皮细胞存在着特殊的缺氧微环境，并通过HIF－1α表达水平提高调节VEGF等血管生成相关因子表达水平升高，促进了新生微血管的出现。

 

【关键词】  缺氧诱导因子－1；血管内皮细胞生长因子；微血管密度；血管瘤

 

 

The study of Expression of HIF-1αand Its relationship to vasculogenesis in infancy hemangioma

Da Chen ,  Xiaoxi Lin*,  Wei Li

Department of Plastic Surgery，Ninth Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai 200011，china.

【Abstract】Objectives: Hypoxia-inducible transcription factor 1α(HIF-1α) is a very important transcription factor that regulates genes involved in metabolism, angiogenesis, proliferation, and apoptosis. This study was designed to investigate the expression of HIF-1α,Vascular endothelial cell growth factor(VEGF) and Microvessel density(MVD) in hemangioma. Method: Immunohistochemical streptavidin/peroxidase(SP) was used to examine the expression of HIF-1α、VEGF and CD34. CD34 was expressed in the cytoplasm of vascular endothelial cell, and we take count of the amount of microvessel which endothelial cell show the positive staining CD34.(the amount of cell in a vessel more than 8 was ignored.). Results: The nuclei and cytoplasm of endothelial cell show the positive immunostaining for HIF-1αin hemangioma. In 28 cases of Hemangiomas ,positive rate for HIF-1αwas 64%,for VEGF was 71.4%.In proliferating phase, positive rate for HIF-1α was 87.5%,VEGF was 93.7%;But in involuting phase, the rate foe HIF-1α was 33.3%,and VEGF was 41.7%. There was a very significantly different between two phases (P<0.01). In proliferating phase, MVD was 73.4±14.63.In involuting phase, MVD was 30.2±9.1(P<0.01). The correlation between  HIF-1α and VEGF was positive (P<0.01). The correlation between  HIF-1α and MVD was positive (P<0.01). Conclusion: Hemangioma in proliferating phase ,There was a specially hypoxia microenvironment in endothelial cell which can upregulated the expression levels of The HIF－1α protein. The HIF－1α protein also upregulated the VEGF protein, result the vasculogenesis in hemangioma.

 

Keywords  Hypoxia-inducible transcription factor 1; VEGF ; MVD; Hemangioma

 

 

氧的动态平衡是生理学和中间代谢系统研究的基础。Semenza于1992年在缺氧诱导的细胞核中提取物中发现当分子内氧含量下降，可以通过一系列信号传导激活对缺氧敏感的缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible transcription factor 1，HIF－1），HIF-1α是其中的主要氧调节亚基；它是近年来备受重视的血管形成和生长有关的转录因子，被认为是实体肿瘤血管新生的关键因素。婴幼儿血管瘤是一种好发于婴幼儿的良性血管源性肿瘤,人们对其增生、消退机制进行了大量研究。但在缺氧和缺氧相关因子在血管瘤中的作用，并未见报道。故我们选取了28婴幼儿血管瘤实体标本，研究血管瘤中HIF-1α的表达和血管形成相关因子，新生微血管密度的关系。

1            材料与方法

1.1 材料

28例婴幼儿血管瘤组织标本是本科室存档的1994年1月～2003年6月的蜡块，其中男性9例，女性19例。标本均按Mulliken分类，按照临床和病理诊断确定其中增生期标本16例，年龄20天～3个月；消退期标本12例，年龄10个月～5岁。同时取2001年1月～2003年6月的动静脉畸形（数字减影动脉造影技术确诊）存档石蜡标本17例，年龄7岁～60岁；正常儿童皮肤软组织15例。

1.2 方法

标本经10％福尔马林固定，常规脱水包埋，作厚度3～4μm的连续切片，进行S-P法免疫组化染色。兔多克隆抗体HIF-1α、VEGF-A以及SABC试剂盒均为Santa Cruz公司产品，工作浓度分别为1∶80；1∶100。鼠抗人单抗CD34购自DAKE公司，工作浓度1：50。HIF-1α经过微波修复抗原，修复时间为16分钟。PBS替代一抗作阴性对照，阳性对照片由试剂公司提供。

1.3 结果判定标准

HIF-1α蛋白以细胞核或胞浆中有棕黄色颗粒为阳性，无反应为阴性。高倍镜下（×400）对每张切片随机选择5个视野，计数200个细胞/视野，共计1000个。阳性细胞数<1％为阴性（－），阳性细胞数小于1％～10％为弱阳性（＋），11％～50％为中度阳性（＋＋），>50％为强阳性（＋＋＋）。

VEGF蛋白以血管内皮细胞胞浆中有棕黄色颗粒为阳性，无阳性反应为阴性。高倍镜下（×400）对每张切片随机选择5个视野，计数200个细胞/视野，共计1000个。阳性细胞数<1％为阴性（－），阳性细胞数小于1％～10％为弱阳性（＋），11％～50％为中度阳性（＋＋），>50％为强阳性（＋＋＋）。

CD34蛋白表达以细胞浆内出现黄色颗粒为阳性标记。微血管密度（Microvessel density, MVD）测定方法：在100倍光镜下挑选微血管分布最高区域,在200倍视野下计数5个视野的血管内皮细胞CD34阳性的血管数目,取其平均值作为微血管密度,每一与邻近的微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或内皮细胞簇都视为独立的微血管；管腔中内皮细胞数目大于8个，给予排除。

1.4 统计学处理

计数资料采用秩和分析和Fisher’s精确检验；计数资料的相关性采用Spearman 等级相关分析；计量资料在进行方差齐性和正态分布检验后，采用多样本单因素方差分析。所有数据统计均在SPSS11.1软件上进行。

2          结  果

            HIF－1α蛋白表达情况

HIF－1α主要表达在血管内皮细胞细胞核上，部分胞浆里也有表达，显棕黄色颗粒；血管内皮细胞周围部分疏松结缔组织细胞也有表达。在巨噬细胞、纤维母细胞聚集的部位，HIF－1α蛋白表达较其他部位更为明显。28例血管瘤标本中，HIF－1α的阳性表达率是64%。其中增生期（n=16）的阳性表达率是87.5%，消退期(n=12)是33.3%，两者差异有显著意义（P<0.01,Fisher’s精确检验）。在正常组织(n=15)和血管畸形病灶(n=17)中，HIF－1α的阳性率分别为13.3%和11.7%和血管瘤增生期比较有显著意义(P<0.01, Fisher’s精确检验）(表1)

            VEGF蛋白表达情况

VEGF主要表达在血管内皮细胞胞浆里（VEGF在平滑肌细胞中均出现阳性表达）。28例血管瘤标本中，VEGF的阳性表达率是71.4%。其中增生期的阳性表达率是93.7%，消退期是41.7%，两者比较有显著意义（P<0.01, Fisher’s精确检验）。在正常组织和血管畸形病灶中，VEGF的阳性率分别为20%和35.3%。和血管瘤增生期比较有显著意义(P<0.01,Fisher’s精确检验)（表 1）

            MVD计数情况

    CD34蛋白主要在血管瘤内皮细胞的胞浆中表达，成黄色。在血管瘤炎症细胞密集部位，CD34表达明显增高。血管瘤增生期MVD计数是73.4±14.63,消退期是30.2±9.1，正常对照组13.9±5.73。（表1）

            HIF－1α、VEGF、MVD三者关系

    血管瘤中HIF－1α和VEGF表达之间两者成正相关(P<0.01)，具有显著意义，HIF－1α表达升高，VEGF表达也升高；MVD和HIF－1α、VEGF成正相关(P<0.01)，具有显著意义。（表2）

3    讨  论

对于婴幼儿血管瘤的发病机制目前仍不清楚，目前提出的几个可能因素是：雌激素和雌激素受体水平增高；血管内皮细胞增殖活跃；肥大细胞增多；细胞外基质、蛋白酶及其抑制物；血管形成因子，尤其是VEGF，BFGF水平增高等;另外随着分子生物学的进步,发现婴幼儿血管内皮细胞中存在的祖内皮细胞。在特定的生理状态下的低氧分压（氧分压为0.5%～5%）环境中，哺乳动物的细胞均会出现HIF－1α蛋白表达水平增高，而过高或过低氧分压下均不会出现该现象^（1）。大量研究中发现实体恶性肿瘤随着肿瘤组织的迅速增生，肿瘤细胞会出现缺氧的现象，肿瘤细胞会表达HIF－1α并诱导肿瘤新生血管的出现。本组病例中婴幼儿血管瘤增生期血管内皮细胞和周围疏松组织细胞中HIF－1α蛋白表达水平明显增高，说明增生期血管瘤血管内皮细胞可能存在着这个特殊的低氧分压微环境。我们推测这可能是血管瘤血管内皮细胞增殖异常活跃造成的。

缺氧状态下可以诱导许多血管新生的相关因子表达，已知HIF－1α直接或间接调控的血管形成相关因子有血管内皮细胞生长因子（VEGF）^（2），胶原生成相关的脯氨酸－4－羟化酶^（3）等。这些因素中VEGF被认为是最关键性因子之一。大量研究表明在血管瘤增生期血管内皮细胞和血清中的VEGF表达水平都明显增高^（4） 对于VEGF表达增高的原因却未阐明。部分学者却认为血管瘤增生期VEGF mRNA表达水平不增高^（5）。但已经证实HIF－1α和VEGF启动基因片断结合，使VEGF mRNA表达水平的增高⁽²⁾。本组病例中在血管瘤的同一部位血管内皮细胞VEGF蛋白表达水平和HIF－1α蛋白表达水平成正相关，说明在血管瘤中HIF－1α是血管瘤内皮细胞VEGF蛋白表达水平的增高重要原因。由此我们认为血管瘤增生期血管内皮细胞VEGF蛋白表达水平的增高和VEGF mRNA转录水平的增高有关^（6）。

MVD被认为是最能反映肿瘤血管生成的指标之一。ＣＤ34在正常及肿瘤性的小血管内皮细胞中都有表达,是一种与新生小血管相关的抗原；利用CD34标记血管内皮细胞可以更准确的统计新生微血管的密度^（7）。本组病例中增生期血管瘤MVD和对照组结果比较有显著意义，镜下可见增生期血管瘤主要由大量新生微血管组成。所以在血管瘤增生期，快速增生应该是大量的微血管大量形成引起，MVD可以代表血管瘤增生的趋势。本组病例中血管瘤的HIF－1α、ＶＥＧＦ蛋白表达水平和ＭＶＤ都成正相关，提示血管瘤内皮细胞HIF－1α蛋白表达水平和血管瘤的增生趋势密切相关。糖皮质激素对血管瘤治疗有效，主要原因是抑止和阻断了某些雌激素受体和雌激素的结合。但临床上仍有大量对糖皮质激素不敏感的病例，这是否和糖皮质激素无法抑止血管瘤内皮细胞的HIF－1α直接诱导血管新生的途径有关有待于进一步研究。

在长期慢性缺氧过程中HIF－1α的作用会发生变化，通过提高Nip3表达水平而启动了Bcl-2相关的细胞凋亡过程^（8）。Bcl-2表达水平下降已经证实是在血管瘤消退期细胞凋亡的主要原因^（10）。HIF－1α可能在血管瘤内皮细胞的凋亡增强中起着重要作用。本组病例中在血管瘤消退期，HIF－1α表达水平逐渐下降，同时MVD减少。可能由于内皮细胞?亡增加导致血管瘤内皮细胞的能量代谢、增殖速度下降，使血管瘤消退期的缺氧得到缓解，HIF－1α水平逐渐下降。HIF－1α在血管瘤中由增殖到消退起到的作用值得更深入的研究。

总之，血管瘤增生期血管内皮细胞存在着特殊的缺氧微环境，并通过HIF－1α表达水平提高调节VEGF等血管生成相关因子表达水平升高，促进了新生微血管的出现，这可能是血管瘤增生的重要途径之一。HIF－1α的抑止药物如YC-1Y^（10）已经取得了良好的临床实验结果，在一些对激素治疗无效的血管瘤病例中，HIF－1α也可能成为新的治疗靶点。

 

 

 

 

 

 

 

 

	n	MVD	F      P	HIF-1a	X2         p**	VEGF	X2         p **
				＋  ＋＋   ＋＋＋		＋ ＋＋  ＋＋＋
增生期	16	73.4±14.63*	127 P<0.0001	2    1    4      9		1   2   5    8
消退期	12	30.2±9.1		8    3    1      0	13.44    0.002	7   3   2    0	13.16    0.002
对照组	15	13.9±5.73		13   2    0      0	18.90  1.37×10-5	12  2   1    0	18.94   1.34×10-5
AVM	17			15   2    0      0	20.76   5.2×10-6	11  3   1    2	12.79    0.0003

表1   血管瘤中HIF－1α、VEGF、MVD的表达

Tab 1  Expression of HIF－1α、VEGF、MVD

* P=0.14>0.05  方差齐  多样本单因素方差分析   ** 秩和分析  增生期和消退期、对照组两两比较

 

HIF     VEGF	+++	++	+	-	MVD
＋＋＋	7	1	1	0	81.9±9.01
＋＋	1	4	0	0	66.8±12,36
＋	0	2	1	1	40±6.68
-	0	0	3	7	30.5±12.6
MVD	81.9 ±9.98	61.3±15.83	46.2±20.51	27.6±9.36

表 2  血管瘤中HIF－1α、VEGF、MVD的相互关系

            Tab 2 Relationship among expression of HIF－1α、VEGF、MVD

HIF and VEGF：r=0.858 P<1×10^-7   VEGF and MVD： r=o.862P <0.001     HIF and MVD：r=0.917P<0.001

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献：

 

1.     Jiang BH, Semenza GL, Bauer C, et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels exponentially over a physiologically relevant ranger of O2 tension [J] Am J Physiol, 1996, 271(4Pt1):C1172-1180.

2.     Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV ,et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. [J]Mol. Cell. Biol. 1996,16(9):4604?4613

3.     Takahashi Y., Takahashi S., Shiga Y, et al. Hypoxic induction of prolyl 4-hydroxylase (I) in cultured cells.[ J] J Biol Chem. 2000, 275: 14139?14146

4.     胡琼华，林晓曦，王炜 .血管瘤病人血清中ＶＥＧＦ的定量检测及意义中华整形外科杂志 2002,18(2):98

5.     Ying Yu, Joyce Varughese, Lawrence F, et al. Increased tie-2 expression,enhanced response to angiopotetin-1,and dysregulated angiopoietin-2 expression in hemangioma-derived endothelial cells.[J] A J P,2001.159(6):2271

6.     Chang J ,Most D ,Bresnick B, et al. Proliferative Hemangiomas : analysis of cytokine gene expression and angiogenesis. Plast Reconstr Surg ,1999,103:1-9

7.     Zolota V ,Gerokosata A, Melachrinou M, et al. Microvessel density, proliferating activity, p53 and bcl-2 expression in in situ ductal carcinoma of the breast. [J] Anticancer Res. 1999,19(4B):3269-74.

8.     Bruick RK. Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia. [J] Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97(16):9082-7.

9.     程立新, 梁杰, 汤少明, 等. 细胞凋亡抑制基因ｂｃｌ-2在血管瘤发病中作用的研究。[Ｊ].中华整形烧伤外科杂志,1999,15(1):35

10.  Yeo EJ, Chun YS, Cho YS et al. YC-1: a potential anticancer drug targeting hypoxia-inducible factor 1.[J]J Natl Cancer Inst. 2003, 95(7):516

 

图 1：血管瘤增生期，HIF－1α表达强阳性，主要在血管内皮细胞核表达。（400倍）

Fig 1：Hemangioma in the proliferating phase, The hypoxia induced factor-1 alpha was expressed strongly in the nuclei of endothelial cell.(400×)

图 2：血管瘤增生期，HIF－1α表达强阳性，主要表达在内皮细胞胞浆中（400倍）

Fig 2: Hemangioma in the proliferating phase, The cytoplasm of endothelial cell show strong immunostaining for HIF－1α.(400×)

 

FIG 3：血管瘤消退期，HIF－1α表达中度阳性，主要表达在内皮细胞胞浆和核细胞核上。（400

图 3：血管瘤增生期，CD34表达阳性。主要表达在血管内皮细胞细胞浆中，巨噬细胞、纤维母细胞增生明显。（200倍）

Fig 3: Hemangioma in the proliferating phase, The cytoplasm of endothelial cell show strong immunostaining for CD34. (200×)

图 4: 血管瘤消退期；内皮细胞CD34阳性表达。（200倍）

Fig 4: Hemangioma in the involuting phase shows CD 34 in the The cytoplasm of endothelial cell (200×)

图 5: 血管瘤增生期 VEGF表达强阳性，主要表达在内皮细胞的胞浆中（400倍）

Fig 5: Hemangioma in the proliferating phase, The cytoplasm of endothelial cell show strong immunostaining for VEGF.(400×)