大颗粒性淋巴细胞白血病的分子学发病机理、临床表现及治疗--来自2012年美国血液学年会的报告

              

吴美博士生 翻译   朱雄鹏教授 审校

 

【摘要】大颗粒性淋巴细胞白血病（LGL）是一类少见的淋巴细胞增殖性疾病，其定义是CD3⁺细胞毒性T淋巴细胞或CD3^-自然杀伤细胞发生的单克隆增生。本篇文章主要讨论LGL白血病的T淋巴细胞型。临床特点包括中性粒细胞减少，贫血及风湿性关节炎。LGL白血病被认为是慢性抗原刺激所致，JAK/STAT3、鞘磷脂及Ras/MEK/ ERK等多种生存信号通路的激活使LGL白血病细胞的长期生存期延长。由于上述的原因导致细胞凋亡及激活诱导细胞死亡的正常通路发生障碍。大部分的LGL白血病患者最终需要治疗，LGL白血病的治疗主要是免疫抑制治疗，初治使用小剂量甲氨喋呤或环磷酰胺。然而，因为缺乏大量的前瞻性研究，目前尚无统一的治疗标准。另外，由于部分患者对现有治疗无明显疗效及没有一种治疗方案能治愈LGL白血病，所以亟需多种新治疗方案以供选择。如果能了解LGL白血病当前的发病机理，有可能为新治疗方案的选择提供新的思路。泉州市第一医院血液科朱雄鹏

  

前言

大颗粒淋巴细胞（LGLs）是直径约15-18μm的白细胞，核呈肾形或圆形，胞浆丰富，含有典型的嗜苯胺蓝颗粒。在正常人中，LGLs约占外周血单个核细胞（PBMCs）的10%-15%。根据细胞的表面标记的不同，这类细胞群又进一步分为两种不同的淋巴细胞系即CD3^-自然杀伤细胞（NK）和CD3⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。LGL白血病是一类少见的慢性CTLs淋巴细胞增殖性恶性疾病，这种淋巴细胞通常浸润多种器官如骨髓、肝脏及脾脏等等。在免疫表型上，LGL白血病细胞来源于CD3⁺CTLs或CD3^-NK ^[1]。根据世界卫生组织(WHO)分类，LGL白血病T淋巴细胞型（T-LGL）属于成熟外周T淋巴细胞白血病的亚群，且不同于侵袭性NK细胞白血病。此外，WHO在2008年提出NK细胞性慢性淋巴细胞增殖性疾病是一种新的暂时性分型。T-LGL白血病的分子学发病机理、临床表现与NK细胞性慢性淋巴细胞增殖性疾病的一些特点相似。

临床表现及诊断标准

本文主要讨论T-LGL白血病(之后称为LGL白血病)。表1总结了这类疾病的临床病理特点及与NK细胞疾病的鉴别诊断。大约在60岁起病时，LGL白血病患者的男女发病率大致相等。约1/3患者在疾病确诊时症状不典型，而2/3患者在发病过程中临床症状逐渐显现出来。临床症状主要包括中性粒细胞减少，贫血和风湿性关节炎（RA）^[2]。85%的LGL白血病患者出现中性粒细胞减少，其中45%患者出现严重的中性粒细胞减少（中性粒细胞的绝对值[ANC] <500/μL）。反复性细菌感染是LGL白血病患者中性粒细胞减少的标志性所致。约5%-35%患者发生逐渐严重的贫血，需要依靠输血治疗^[3]。有多种机制可以导致贫血包括自身免疫性溶血性贫血、纯红再障。据报道，几乎每个LGL白血病患者都出现RA^[2]，而且通常在LGL白血病发病前诊断为RA。STAT3突变的激活与出现LGL/Felty综合征表型相关（如中性粒细胞减少和RA）^[4]。约20%-50%患者出现脾脏肿大；约20%患者出现血小板减少^[3]。

当出现不明原因的细胞数减少或RA时，患者需要检测循环性的LGLs。当单克隆性LGLs增多时可诊断为LGL白血病（见图1）^[5-7]。可以通过外周血涂片或流式细胞术检测LGL细胞数。外周血LGLs的正常值<0.3×10⁹/L。最初，当循环性的LGLs>2×10⁹/L时诊断为LGL白血病，但目前在适当的临床环境下，较低的细胞数值（0.4-2×10⁹/L范围）就符合LGL白血病的诊断标准。免疫表型分析显示LGL白血病细胞是终末效应记忆性T细胞（CD45RA+CD62L^-）^[8]。（80%-90%）大部分LGL白血病患者出现CD3⁺CD8⁺CD57⁺ CD56^- CD28^-，TCR-αβ⁺ 等免疫表型^[3]。也可出现CD4⁺与或不与CD8⁺共表达等少见的免疫表型。低于10%的患者出现TCR-γΔ免疫表型，这与TCR-αβ免疫表型的临床相似，且3年生存率达85%。通过印迹法和/或PCR检测TCR基因重排可以明确克隆性。最近，流式细胞术通过显示TCR Vβ家族的表达用于检测细胞的克隆性，因为mAbs可以检测约70%TCRβ链的可变区^[10]。当患者的LGL细胞数较低时，建议行骨髓穿刺和病理检查有助于诊断。病理发现淋巴间隙出现CD8⁺，TAI-1(+)和颗粒酶B（+）呈线型浸润时支持LGL白血病的诊断。

LGL白血病的分子学发病机理

在受到感染或抗原刺激期间，LGLs出现大量增殖，是受感染或抗原刺激的原始靶细胞数的50 000倍，一旦抗原清除，部分细胞是通过激活诱导细胞死亡（AICD）程序被消除。然而，在LGL白血病患者中，由于AICD程序发生障碍，被刺激的CTL细胞不能发生有效的凋亡，最后导致外周血中的LGLs增多。另外，在LGL白血病患者中发现了多种持续性激活的细胞生存通路如JAK2/STAT3^[4,11]，鞘磷脂 ^[12-15]，RA/MEK/ERK^[16] 及SFK/PI3K/Akt^[17,18] 。一种系统性生物学方法检测发现IL-15和PDGF是主要生存信号通路之间进行转换的细胞因子，这对目前所知的由于调节障碍发生的T-LGL白血病有着深远的影响^[13]。研究发现STAT3突变与LGL白血病的发生密切相关，提示STAT3的信号传导通路异常是LGL白血病的发病机理^[4]。图2总结了LGL白血病的细胞增殖及生存信号传导通路的发生的调节障碍。

LGL白血病Fas与Fas配体介导的凋亡障碍

Fas属于TNF受体家族成员，参与死亡信号通路的转换。Fas配体（FasL）与Fas之间相互作用促使诱导死亡信号复合物（DISC）的形成和一些凋亡因子的激活。在生理条件下，当抗原清除后，被刺激的CTLs部分通过Fas-FasL通路启动的AICD程序而被消除。然而，尽管LGL白血病细胞表面高表达Fas及FasL且Fas受体基因无突变，但这种死亡通路不能清除LGL白血病细胞^[19]。另外，研究显示T-LGL白血病患者的细胞在与Fas受体交联后Fas诱导的DISC存在受损^[8]。进一步研究发现LGL白血病细胞过度表达DISC的抑制蛋白c-FADD

，类似IL-1的c-FLIP，能引起DISC的重组减少及对Fas-FasL介导的凋亡产生抵抗^[8]。再者，在LGL白血病患者而不是正常人的血清中检测到能阻止依赖Fas凋亡的可溶性Fas（sFas）^[20]。据说在LGL白血病中，sFas与Fas相互竞争为可溶性DcR，能阻止Fas介导的细胞凋亡。受损的Fas-FasL介导的细胞凋亡成为LGL白血病的发病机制。

IL-15

IL-15属于IL-2家族成员，通过改变Bcl-1家族成员（如Bcl-2和Bcl-XL）的表达来调节T和NK细胞的激活和增殖。IL-15提供的长期生存信号能维持正常的NK和CD8⁺记忆性T细胞的生存^[13]，并且对LGL白血病细胞的生存起到重要的作用。IL-15抑制剂能引起LGL白血病细胞凋亡^[21]，而在IL-15转基因小鼠中，用抗IL-15抗体干扰IL-15信号能阻止LGL白血病的发生^[22]。在NK细胞中，IL-15通过上调E3连接酶E3泛素蛋白连接酶双微体2（HDM2）而特异性的降低BH3结构域凋亡诱导蛋白抗原（Bid）水平，由于HDM2能作用于Bid进行蛋白酶体降解^[21]。有趣的是，经蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗后，低水平的Bid反而能引起LGL白血病细胞凋亡^[21]。最近发现IL-15的可溶性受体亚单位IL-15Ra能上调部分T-LGL白血病患者的PBMCs^[23]。与正常人的PBMCs相比，加入外源性IL-15后T-LGL白血病患者的PBMCs呈高水平增生。在T-LGL白血病中，高水平表达的IL-15Ra通过降低IL-15反应阈值而促使T-LGL白血病的发生。

PDGF

PDGF是一种生长因子，研究发现PDGF能介导T和NK细胞来源的LGL白血病细胞的生存。网络模型认为IL-15和PDGF在LGL白血病中发病机制中发挥着重要的作用^[13]。LGL白血病细胞的生存依赖于PDGF的自分泌。PDGF通过激活PI3K-Akt和MER/ERK通路来调节白血病性LGLs的长期生存。

LGL白血病的STAT3持续性活化

JAK/STAT信号通路控制各种生物学的过程如细胞增殖，凋亡，血管生成及免疫反应。STAT3是一种重要转录因子，在维持细胞生存中起着重要的作用。大约在22种以上的肿瘤中可以观察到STAT3的持续性活化。当细胞因子及生长因子分别与相应的受体（细胞因子受体和生长因子受体）结合后活化STATs形成二聚体并进入细胞核内发挥转录活性。在2001年，研究发现LGL白血病患者（N＝19）的白血病细胞出现STAT3的持续性活化。STAT3通过调节抗凋亡蛋白（如Mcl-1）的表达延长LGL白血病细胞的生存期^[11]。近期，基因组研究发现40%（33/77）的LGL白血病患者出现STAT3持续性活化的原因在于激活发生突变的体细胞的STAT3的SH2结构域，而这种结构域能促使STAT3的二聚体形成及激活^[4]。LGL白血病患者的STAT3通路的下游靶基因（如IFNGR2，JAK2和Bcl2L1）出现上调^[4]。STAT3抑制剂可能成为LGL白血病的理想靶向治疗。

NF-κB持续性活化

NF-κB是一种转录因子，在免疫细胞的造血、增殖及生存等方面有着重要的作用。在静止状态下，NF-κB与NF-κB抑制蛋白IκB结合位于细胞质内。一旦激活NF-κB通路，IκB通过IκB激酶复合物而被磷酸化导致IκB降解及NF-κB的活化。NF-κB促进促生存因子Bcl-2家族成员及抑制凋亡蛋白的表达。有趣的是，白血病性LGLs表达高水平的NF-κB家族成员c-Rel ^[13]，比正常人的PBMCs具有更高的NF-κB活性。Akt和NF-κB的药理抑制剂说明NF-κB通过不依赖STAT3的Mcl-1激活PI3K-Akt的下游通路而阻止凋亡^[13]。

LGL白血病的鞘磷脂变阻器失衡

鞘磷脂及其代谢产物在细胞增殖，凋亡及迁移等不同的生物学过程中起着重要且相反的作用。是促凋亡的鞘磷脂（如神经酰胺和鞘氨醇）和促生存的鞘磷脂（磷酸鞘氨醇[S1P]）之间的平衡而不是这些分子的绝对数值决定细胞的结局（鞘磷脂变阻器）。分子图谱分析显示鞘磷脂变阻器在LGL白血病中发生调节障碍即促凋亡的细胞因子（如神经酰胺）与促生存的细胞因子（如S1P）之间失去平衡，倾向于促生存的细胞因子^[12]。例如，在LGL白血病中，酸性酰胺酶（ASA H1）出现持续性上调导致神经酰胺的水平下降并促使LGL白血病细胞生存^[12]。用于NK-LGL白血病的小鼠模型中的ASAH1抑制剂或C6-神经酰胺在体内外均可引起白血病性LGLs的死亡^[14]。另外，将鞘氨醇转化为S1P的鞘氨醇激酶1（SphK1）在LGL白血病患者中呈过度表达状态。SphK1的药理学抑制剂SKI-I或S1P抑制剂FTY720能明显诱导白血病性LGLs发生凋亡^[15]。再者，S1P受体（S1PRs）的表达水平也明显升高，特别是S1PR5在白血病性LGLs中呈持续性过度表达^[12]。鞘磷脂变阻器的调节障碍促使LGL白血病的进展。因此，针对鞘磷脂途径的靶向治疗有可能成功的治愈LGL白血病。

     Ras/Raf/MEK/ERK信号的持续性活化

Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路控制细胞的增殖、生存、分化、凋亡、迁移及代谢等多种基本的生物学功能。Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路转换生长因子（如PDGF），G蛋白耦联受体（如S1PR5）及NK-κB等各种来源的信号用于激活转录因子（如Ets家族的Fos和Jun）或直接促使FLIP及Mcl-1的转录。在所有的肿瘤患者中，大约30%患者出现这条信号传导通路的重要组成部分发生突变。

据报道，Ras/Raf/MEK/ERK信号在NK-LGL白血病患者中呈持续性活化状态。抑制Ras能引起ERK的抑制并促进患者白血病细胞的凋亡。ERK的抑制剂（如PD98059和U0126）或显性阴性型MEK能缩短患者细胞的生存期^[16]。因此，研究发现Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路的持续性活化有助于LGL白血病细胞的生存。

PI3K/Akt通路的调节障碍

PI3K/Akt信号传导通路在促进细胞增生，生存及肿瘤的进展等方面起着关键性作用。生长因子通过Src 家族激酶（SFK）或Ras的信号级联放大效应激活PI3K/Akt信号。PI3K/Akt通路下游的主要靶点包括促生存转录因子NF-κB，Bad及pro-caspase 9。在LGL白血病中，SFK维持PI3K呈持续性激活状态，导致Akt和GSK3的持续性磷酸化^[18]。激活后，PI3K/Akt信号通过抑制Fas聚集和DISC的形成从而延长T细胞的生存期。仅仅使用PI3K/Akt信号通路抑制剂就可引起T-LGL白血病细胞发生自发性凋亡^[18]。上述的结论显示激活的PI3K/Akt信号通路可以保护白血病性LGLs避免发生凋亡。

总之，Fas/FasL，IL-15，PDGF，JAK/STAT3，NF-κB，鞘磷脂，Ras/MEK/ERK ，PI3/Akt等多种信号通路在LGL白血病中均发生调节障碍。针对这些调节障碍的信号通路研发的各种药物治疗正在进行临床试验用以治疗不同的肿瘤，将来使用于治疗LGL白血病的临床试验成为可能（表2）。

LGL白血病治疗方案的选择

目前，LGL白血病尚无统一的治疗标准。对那些症状不典型且病程进展缓慢呈惰性状态的LGL白血病患者，可采用观望的方法及单一注射G-CSF以检测髓系祖细胞的动员能力，一旦患者对G-CSF有反应并出现中性粒细胞减少性发热时需紧急处理。对症状明显的患者需要采用免疫抑制治疗包括重度或中度贫血（如依靠输血或症状性贫血）和重度或中度中性粒细胞减少（如ANC<500或与ANC> 500引起的反复感染）。最后，合并RA且有症状的患者需要治疗^[7]。

治疗方案的总结见图3^[7]。主要的治疗方案主要采用免疫抑制治疗，据报道单一使用甲氨喋呤（MTX），口服环磷酰胺或环孢素A对LGL白血病有疗效。我们推荐合并有中性粒细胞减少和/或RA的LGL白血病患者初治时采用低剂量的MTX。合并贫血的LGL白血病患者首选MTX(10mg/m²/wk 口服)或环磷酰胺（100mg/d 口服）。治疗效果应在治疗开始后4个月进行细胞计数。当血细胞计数恢复到正常范围内（如血小板>150×10⁹/L，ANC>500/μL，血红蛋白>12g/dL，淋巴细胞<4×10⁹/L ）及循环性LGL在正常范围时，达到血液学完全缓解(CR)。另外，PCR尚未检测到克隆性T细胞时为达到分子学完全缓解。当血细胞计数有所改善但又没达到完全缓解时为部分缓解（PR）。当治疗后4个月没达到CR或PR时定义为治疗失败。如果治疗后一次PR都没达到可考虑换其他抑制剂或环孢素（2.5-5mg/kg Bid）。下面几部分简单介绍一下LGL白血病的有效治疗方案。

MTX广泛用于治疗RA。1994年首次报道少部分LGL白血病患者采用MTX治疗后50%的患者达到血液学缓解^[25]。其它的研究报道MTX的治疗反应率为39%-67%^[7]。最近，东部肿瘤协作组（ECOG）的一项大规模的前瞻性试验显示初次使用MTX的治疗反应率为39%^[26]。一般而言，MTX具有很好的耐受性。与小剂量的MTX相关的副作用包括肝损害和少见肺功能障碍。当转氨酶超过正常值范围的2倍时，可暂停MTX或调整剂量。对MTX有反应的患者可以继续使用。

环磷酰胺属于烷化剂，是广泛用于治疗各种肿瘤和部分自身免疫性疾病的一种前体药物。在法国，部分LGL白血病患者使用环磷酰胺具有良好的总体反应率，与MTX相比，两者的反应率分别为66%和55%^[6]。资料显示环磷酰胺可作为一线治疗方案^[6]。由于达到任何形式的缓解都需要1-4个月的时间，所以同样用4个月来评价药物治疗的反应情况。至少达到一次PR的患者继续使用环磷酰胺9-12个月，可以避免剂量依赖性的骨髓增生异常综征/急性髓系白血病等少见并发症的发生。

环孢素是另一种一线治疗药物。我们首选MTX或环磷酰胺是因为环孢素具有广泛的毒副作用^[7]。需要经常监测肾功能和血压，有时因副作用而终止治疗。很清楚的是环孢素需要一直使用因为停药会引起疾病的复发。虽然只有不到40例的患者使用嘌呤类似物，但总体反应率是令人可喜（79%或30/38例）^[27]。由于治疗周期短（从1个月到4至6个月），高反应率，低毒性，诱导持久性缓解等优势，可可考虑选择嘌呤类似物进行临床试验。

这里有少量的有关LGL白血病的小临床试验。R115077（替吡法尼，商品名Zarnestra）是脂肪酸转移酵素抑制剂用于抑制Ras介导的信号传导通路。II期临床试验中的8例LGL白血病患者尚未达到临床血液学缓解^[28]。但在大部分患者中可观察到有意义的生物学反应包括外周血和骨髓中的LGL下降，骨髓造血功能的改善及促进体外造血性的集落生长。另外，R1150777治疗可以改善LGL白血病患者的肺动脉高压症状^[29]。人抗CD52抗体阿仑单抗能选择性杀伤表达CD52的细胞。有趣的是，白血病性T-LGLs表达CD52。在一项研究中，阿仑单抗的总体反应率为50%（4/8例T-LGL白血病患者）^[30]。目前，阿仑单抗处于II期临床试验中用于治疗T-LGL白血病^[31]。美国食品及药物管理局（FDA）批准经过烷化剂治疗及氟达拉宾治疗失败的CLL患者可选择阿仑单抗作为二线药物治疗^[32]。

人抗MiK-β1抗体直接作用于CD122，CD122是IL-2R和IL-15R的共同亚单位。I期临床试验完成了人抗MiK-β1抗体用于治疗T-LGL白血病患者^[33]。虽然在白血病性LGL中观察到IL-15β亚单位出现下调，但LGL数却无下降。

最近，体外光分离置换法用于治疗5例难治性/复发性LGL白血病患者，其中2例达到一次CR^[35]。当难治性/复发性LGL白血病患者的有效治疗方案的选择有限时，可选用体外光分离置换法。表2列出了针对LGL白血病信号通路调节障碍的其它药物。这些治疗方案可用于进行临床试验。

总结

LGL白血病是一种CTLs单克隆疾病。LGL白血病的主要治疗方案是免疫抑制剂。然而，目前没有一种治疗方案能治疗这种疾病，所以需要选择新的治疗方案。通过对几种重要的调节障碍的信号传导通路的认识极大的加速了治疗LGL白血病的潜在性靶点的新药物的研发。希望针对这些发生调节障碍的信号传导通路进行的临床试验的新药物将来对LGL白血病患者有疗效。

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