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- 赵兰才主任医师 副教授
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- 三参保肺颗粒对吸烟致大鼠虚喘模型的抗肺纤维化作用及其机制研究
- 作者:赵兰才|发布时间:2010-08-26|浏览量:800次
赵兰才
摘要: 建立慢性阻塞性肺病(COPD)合并肺间质纤维化大鼠模型,探讨三参保肺颗粒对虚喘模型肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β受体1(TβR1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)蛋白表达的影响。方法:实验于2001年6月/2001年9月在北京中医药大学病理实验室进行,用熏香烟烟雾加气管内注入弹性蛋白酶和博来霉素方法建立慢阻肺合并肺纤维化大鼠虚喘模型;通过免疫组织化学方法显示三参保肺组、模型组、和对照组大鼠支气管肺组织TGF-β1 、TβR1 、bFGF的蛋白表达。结果:三参保肺组及模型组TGF-β1 、TβR1 、bFGF在支气管粘膜、肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞、肺间质细胞、成纤维细胞均有表达,三参保肺组表达的程度较模型组为弱;经图象分析显示三参保肺组bFGF表达的灰度值(39.27±10.94)低于模型组(53.44±14.80),差异有非常显著性意义(P<0.001),结论:三参保肺颗粒可抑制支气管肺组织TGF-β1 、TβR1 、bFGF的蛋白表达,起到减轻肺血管内皮细胞、成纤维细胞增殖、抗肺纤维化的作用。中国中医科学院西苑医院感染疾病科赵兰才
引言
在用熏香烟烟雾加气管内注入弹性蛋白酶和博来霉素的方法建立了肺气虚证慢阻肺合并肺纤维化金黄地鼠模型的基础上[1],采用同样方法建立慢阻肺合并肺纤维化大鼠虚喘模型,观察三参保肺颗粒对模型肺组织TGF-β1 、TβR1 、bFGF蛋白表达的影响。
1 材料和方法
1.1材料:实验于2001年6月/2001年9月在北京中医药大学病理实验室进行,取三级Wistar大鼠40只,雄性,质量140~160g,有中国药品生物制品鉴定所实验动物中心提供,动物饲养室为二级动物室,室内温度20℃±2℃,相对湿度为40%~50%,光照充足。
1.2试剂:弹性蛋白酶(德国勃林格公司生产),博来霉素A5(天津太河制药公司生产),大前门牌香烟(上海卷烟厂);SP-9001免疫组化试剂盒,兔TGF-β1 、bFGFIgG多抗,生物素化山羊抗兔IgG,辣根酶标记链霉卵白素,DAB显色试剂盒,以上均为北京中山生物技术有限公司提供;兔TβR1IgG多抗(武汉博士德生物技术有限公司生产)。过氧化氢(分析纯,北京化学试剂厂),柠檬酸盐缓冲液,质量浓度40g/L多聚甲醛,0.5mol/LTBS(北京中医药大学病理教研室提供)。
1.3主要仪器:VX型万能显微镜(日本Olympus),精密电子天平(德国),55cm×53cm×62cm动物熏烟箱(北京协和医科大学阜外医院提供),CMIA-008型多功能真彩病理图象像分析系统(北京航空航天大学图像中心生产)。
1.4设计、实施及评估:采用香烟烟雾吸入加气管注入弹性蛋白酶和博来霉素法建立大鼠虚喘模型,香烟烟雾吸入法可造成动物气流阻塞和支气管炎改变[2],弹性蛋白酶气管内注入法是造成肺气肿的稳定、可控的方法[3],气管内注入博来霉素为建立肺纤维化动物模型的经典方法[4]。既往的实验研究表明香烟熏吸叠加气管内注入弹性蛋白酶和博来霉素可成功建立金黄地鼠和大鼠肺气虚证慢阻肺合并肺纤维化模型[1] [5],通过大鼠肺功能测定、HE染色、天狼猩红染色、肺组织匀浆羟脯氨酸含量测定等方法证实大鼠模型符合人类COPD合并肺纤维化的病理形态和功能改变,香烟烟雾吸入和气管内注入弹性蛋白酶的方法是通过了北京协和医科大学阜外医院病理实验室专家的指导和培训。
1.5干预措施:将大鼠置于熏烟箱内,每9支香烟相接,一端固定于熏箱顶部,点燃香烟下端,任其自燃,燃毕换另9支,每周6天,连续4周,第29天按照张旭晨报道的方法[3]气管内注入弹性蛋白酶(300单位/kg体重),第35天气管内注入博来霉素(5mg/ kg体重),继续饲养4周后取材。
1.6分组及取材:随机分为模型组、三参保肺组、对照组,每组10只,模型组按上法制作,三参保肺组在模型制作开始每日三参保肺颗粒(由北京中医药大学药学院提供,成分为党参、丹参、蛤蚧、炙麻黄、汉防己、紫菀等9味药组成)水溶液灌胃(14g/kg),对照组仅于第29天、35天气管注入生理盐水(2ml/kg),各组于第9周末处死,取右肺下叶,在右下肺叶最大横径处切3-4mm厚标本块,常规脱水,石蜡包埋,切片。
1.7评估标准:免疫组织化学方法:石蜡切片常规脱蜡进水,体积分数0.03的过氧化氢孵育10min,蒸馏水冲洗2min×3次,TBS洗5min;将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置微波炉内加热15min,使溶液温度保持在92~98℃;用体积分数为0.1的山羊血清孵育30min;倾去山羊血清,加1:100稀释的一抗,4℃冰箱过夜,TBS冲洗;加1:200稀释的生物素标记的二抗,37℃30min,TBS冲洗;DAB溶液显色,蒸馏水洗,脱水、透明、封固。阴性对照组用正常山羊血清替代一抗,其余步骤同上。
1.8主要观察指标:显微镜下观察免疫组化阳性表达的细胞及细胞簇,呈棕黄色颗粒,阴性对照组则无表达;用多功能真彩色病理图像分析仪计算各组bFGF免疫组化阳性表达颗粒的平均灰度值。
1.9统计学分析:应用SPSS软件,由第一作者做t检验。
2 结果
2.1 描述性统计
2.1.1实验动物数量分析:对照组动物无死亡,模型组死亡3只,三参保肺组死亡2只,原因是造模时间长,干预方法多,动物因感染及呼吸衰竭而死亡。大鼠死亡后该组未随机补充。
2.1.2 TGF-β1:对照组支气管黏膜上批细胞、血管内皮细胞及支气管周围炎性细胞有少许棕黄色颗粒;模型组黏膜上皮细胞、血管内皮细胞、支气管周围炎性细胞、肺泡上皮细胞、肺间质巨噬细胞、成纤维细胞及肺泡腔巨噬细胞均有强阳性表达(图1),三参保肺组阳性细胞表达的部位同模型组,但表达的程度较模型组为弱(图2)。
2.1.3 TβR1:对照组支气管内批皮细胞、平滑肌细胞、肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞有弱阳性表达;模型组支气管周围炎性细胞、肺泡间质巨噬细胞、肺泡上皮细胞和间质成纤维细胞有强表达(图3),三参保肺组阳性表达部位同对照组,但阳性表达的程度较模型组为弱(图4)。
2.1.4 bFGF:对照组血管内皮细胞、支气管黏膜上皮细胞及肺泡巨噬细胞有阳性表达,模型组大量血管内皮细胞、支气管黏膜和肺泡上皮细胞、肺间质细胞有强表达(图5),三参保肺组见少量支气管黏膜上皮细胞、血管内皮细胞及肺泡间质细胞有阳性表达,但较模型组表达程度为弱(图6)。
2.2 统计推断:每组取5张玻片,每张玻片取4个高倍视野,用图像分析仪分析各组bFGF阳性表达染色的平均灰度值,结果对照组为28.247±9.162,模型组为49.438±14.801,三参保肺组为39.269±16.940,模型组与对照组比较有非常显著差异(t=5.444,P<0.001)三参保肺组与对照组比较也有非常显著差异(t=4.952,P<0.001),三参保肺组与模型组比较,结果示三参保肺组组灰度值显著低于模型组(t=2.971,P<0.01)。表明三参保肺颗粒有减轻慢阻肺合并肺纤维化大鼠支气管及肺间质bFGF含量的作用。
3 讨论
研究表明转化生长因子-β(TGF-β)在肺纤维化和COPD发病中起重要作用。TGF-β是一类在组织损伤修复、结构重建和纤维化形成中具有重要作用的生长因子,其中TGF-β1在纤维化过程中扮演着核心角色,与肺纤维化的关系最为密切[6]。TGF-β1须与特异性受体结合才能实现其生物学功能,受体有三型:TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ,其中TβRⅠ、TβRⅡ是信号传递所必须的,TGF-β与TβRⅠ、TβRⅡ结合形成TβRⅡ-TGF-β- TβRⅠ异聚体复合物,TβRⅡ的磷酸化使TβRⅠGS区5个丝氨酸/苏氨酸激酶活化,导致胞内某些蛋白质的磷酸化,进而介导相应的生物学效应[7,8]。TGF-β及其受体主要通过刺激细胞外基质成分的合成,抑制胶原酶、弹性蛋白酶、金属蛋白酶等的分泌以抑制细胞外基质的降解等途径参与肺纤维化的形成[9]。TGF-β在COPD支气管重塑中亦起着重要作用,夏氏等[10] 用免疫组织化学方法观察TGF-β在11例COPD组纤维支气管镜标本组织的表达,结果显示:(1)TGF-β在COPD组支气管粘膜上皮细胞、粘膜下层细胞、平滑肌细胞、粘膜腺体、内皮细胞、细胞外基质、上皮下基底膜的胶原带均有强阳性表达,支气管粘膜上皮细胞基底膜是主要阳性表达区。(2)TGF-β表达强度与基底膜厚度和纤维细胞数呈正相关;认为TGF-β可能参与COPD气道重建时纤维化的形成过程,并在此过程中起重要作用。本实验结果显示模型组TGF-β1、TβR1在支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞、支气管周围炎性细胞、肺泡上皮细胞、肺间质巨噬细胞、成纤维细胞及肺泡腔巨噬细胞均有强阳性表达,与文献报道[11]的一致,表明造模致大鼠肺组织损伤时TGF-β1、TβR1表达增高,而三参保肺颗粒组与模型组比阳性表达细胞较少,提示三参保肺颗粒可减少TGF-β1、TβR1在肺组织的表达, 推测其机理可能与三参保肺颗粒减轻炎症反应、从而减少TGF-β1及其受体的合成和分泌有关。寻找抑制肺组织TGF-βmRNA表达及蛋白产生的药物已成为抗纤维化药物研究的重点,本实验结果表明三参保肺颗粒可抑制TβR1蛋白的表达,提示三参保肺颗粒可能通过抑制TGF-β1信号由胞浆向胞核的传递,减少细胞外基质的合成而起到抗肺纤维化作用。
碱性成纤维生长因子(bFGF)在肺纤维化和COPD发病中也起重要作用,宋氏等[7]用免疫组化及原位杂交法检测慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型bFGF蛋白和基因表达的相对含量,并用图像分析系统检测支气管平滑肌及胶原厚度,结果表明模型组bFGF在支气管粘膜上皮、肺小动脉内皮和肺泡巨噬细胞的表达显著增强,支气管上皮细胞bFGF与平滑肌厚度、肺小动脉内皮细胞bFGF与平滑肌厚度之间均呈正相关,认为bFGF在气道重塑和肺小动脉重建中可能起重要作用。本研究显示模型组bFGF在血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞和及成纤维细胞有强阳性表达。经图像分析显示三参保肺组bFGF与模型组比灰度值显著降低(P<0.01),表明三参保肺颗粒可降低慢阻肺合并肺纤维化大鼠肺组织中bFGF含量。bFGF具有很强的促细胞增殖活性及促血管生长作用,可促进成纤维细胞游走、增殖,促进肌纤维细胞分化和细胞外基质的产生,并能促进肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖、分化,促进血管内皮细胞的增殖[8]。三参保肺颗粒组可降低大鼠肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞bFGF表达,提示三参保肺颗粒可减轻肺血管内皮细胞、成纤维细胞的增殖、活化及肺血管重塑。
参考文献
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