泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠NO和NOS的影响

摘要：目的：观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎( Ulcerative Colitis, UC)大鼠NO含量及NOS活性的影响，探讨该方治疗UC可能的作用机制。方法: 采用三硝基苯磺酸( 2, 4，6-trin itrobenzenesu lfonicacid, TNBS ) -乙醇联合造模法诱导大鼠溃疡性结肠炎动物模型, 实验分为空白组(BK)、模型组(MK)、柳氮磺胺吡啶组(SK)、泄浊解毒方小剂量组(LK)、泄浊解毒方大剂量组(HK)5组。用硝酸还原酶法检测UC大鼠血清及结肠粘膜中的NO含量、化学法检测UC大鼠血清及结肠粘膜中的NOS活性。结果: UC大鼠血清及结肠粘膜中NO含量及NOS活性明显高于对照组，泄浊解毒方可以显著降低UC大鼠血清中及结肠粘膜中的NO含量及NOS的活性。结论：泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠有良好的治疗作用, 其作用机制可能与降低大鼠血液及结肠粘膜中NO含量及NOS的活性有关。河北医科大学中医院消化内科刘建平

关键词: 溃疡性结肠炎；动物实验；泄浊解毒方；NO；NOS；作用机制

中图分类号: R285.5 文献标识码: A

Investigating the Effect of Decoction of Xie - zhuo Jie - du on NO, and NOS in Rats with Ulcerative Colitis

ZHOU Hong-wei,LIU Jian-ping, RONG Ying-rui, REN Jie

(He bei Medical University, Shijiazhuang, 050011, China)

Abstract: Objective: To observe the effects and mechanism of Xie-zhuo Jie-du Decoction on the expression of NO and NOS in ulcerative colitis rat. Methods: The an imal model of ulcerative colitis was made by trinitro - benzene- sulfonicacid combined with ethano.l All the rats were divided into 5 g roups randomly, which were blank group, model group, control

group and treatment group of low dose and treatment group of high dose.

Nitrate reductase assay the content of NO in the rats’serum and colonic mucosa .the chemical assay of NOSactivity in the rats’serum and colonic mucosa .Result:NO and NOS in the UC serum and colonic mucosa was significantly higher. Xie-zhuo Jie-du Decoction can significantly reduce the expression of NO and NOS in the UC rats’ serum and colonic muco-

sa.Conclusion: Xie- zhuo Jie- du Decoction has good and reliable therapeutical effect on ulcerative colitis, and its mechanism of action may be related to decreasing the expressions of NO and NOS in the UC rats’ serum and colonic mucosa.

 

溃疡性结肠炎（UC）是一种发生于结肠粘膜的慢性非特异性炎性疾病。其病因和发病机制尚不十分清楚，目前许多研究表明其发病机制与环境的激发因素、遗传易感性、感染因素及免疫介导的组织损伤等因素有关^[1-6]。NO作为体内重要的生物信使分子，参与炎症与组织的损伤，在消化、循环、免疫等全身多系统的生理、病理及有关的临床疾病中起着重要的作用。在其释放的同时伴随有超氧阴离子及毒性自由基的产生，其与NO共同作用，引起组织细胞的氧化损伤和坏死。因此，NO在UC发病机制中所起的作用受到越来越多的关注^[7]。NOS（nitric oxide synthase，NOS）作为合成NO关键限速酶之一，在NO的合成中起着重要的作用。本研究是通过动物实验的方法，采用导师经过多年临床经验筛选出的经验方泄浊解毒方对UC大鼠进行治疗，探讨其治疗机理。

材料与方法

1动物 健康清洁级Wistar大鼠45只，体重220~250g，雄性，适应性喂养1周。动物等级：一级。由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：905013。

2 实验药物与试剂 泄浊解毒方(鱼腥草、黄连、黄芩、红藤、败酱草、车前子、半夏、葛根、薏苡仁、木香)为中药复方，原液每毫升含生药2.0g(成人每天每公斤体重1.45g)，由河北省中医院药剂室提供，4℃冰箱保存备用。泄浊解毒方小剂量组、大剂量组分别按10.0g/kg、20.0g/kg灌胃给药，约相当于临床成人日用量的7倍、14倍，柳氮磺胺吡啶片(sulfasalazine tablets, SASP)，规格：250mg/片，上海三维制药有限公司生产，批号：200906C12。用前将片剂研细粉，过100目筛，用蒸馏水配成混悬液，按0.3g/kg体重灌胃给药。三硝基苯磺酸(TNBS)：美国Sigma公司；一氧化氮试剂盒：南京建成生物科技有限公司；一氧化氮合酶试剂盒：南京建成生物工程研究所； 蛋白检测试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司。

3 实验方法 随机抽取8只大鼠作为空白组(BK)，其余大鼠参照相关文献方法^[7-8]复制溃疡性结肠炎动物模型。随机处死5只大鼠确认造模成功，将剩余造模大鼠随机分为模型组(MK)、柳氮磺胺吡啶组(SK)、泄浊解毒方小剂量组(LK)、泄浊解毒方大剂量组(HK)4组，每组8只。处理:造模后第5天，BK、MK每天予生理盐水10ml/kg灌胃；SK、LK、HK分别给予柳氮磺胺吡啶液0.3g/kg、泄浊解毒方水煎10.0g/kg、泄浊解毒方水煎剂20.0g/kg灌胃，每日1次，连续2周。

4标本采集 造模后第15天，将禁食24小时的大鼠以2%戊巴比妥钠(3ml/kg)麻醉后，解剖大鼠沿矢状线正中切开，股动脉取血处死。取血2ml，4℃3000rpm离心20分钟，分离血清，-20℃保存待测；留取肛门至回盲部的结肠标本8cm，沿肠系膜纵行切开，以冷生理盐水冲洗掉肠内容物，迅速放入液氮中冷冻，-70℃保存待测。

5观察指标 用硝酸还原酶法检测UC大鼠血清中及结肠粘膜中NO含量；用化学法测定UC大鼠血清中及结肠粘膜中NOS活性。采用南京建成生物研究所试剂盒，操作按说明书步骤进行。

6统计方法 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，实验数据以均数±标准差(±S)表示，各组均数的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD，P＜0.05作为有统计学意义的判定标准。

结果

1用硝酸还原酶法检测UC大鼠血清NO含量、化学法检测UC大鼠血清中NOS活性

与BK组相比，MK组血清NO含量及NOS活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与MK组相比，SK组血清NO含量及NOS活性降低，差异有显著性差异(P<0.05)；SK组与LK组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；与SK组相比，HK组血清NO含量及NOS活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与LK组相比，HK组血清NO含量及NOS活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)。（见表1）

2用硝酸还原酶法检测UC大鼠结肠组织NO含量、化学法检测UC大鼠结肠组织中NOS活性

与BK组相比， MK组大鼠结肠组织NO含量及NOS活性上升，差异有统计学意义（P<0.05）；与MK组相比，SK组、LK组及HK组大鼠结肠组织NO含量及NOS活性较，均降低，其中，HK组与MK组相比，大鼠结肠组织NO含量及NOS活性明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；LK组、SK组大鼠结肠组织NO含量及NOS活性与MK组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）; HK组与SK组相比，大鼠结肠组织NO含量及NOS活性明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。（见表2）

 

表1 UC大鼠血清NO 和NOS活性

group       n           NO(μmol/L)          NOS(U/ml)

BK       8     25.332±1.787        20.323±0.496

MK         8         31.640±1.540^△       25.767±0.945^△

SK         8         28.131±1.527^*       23.478±0.901^*

LK         8         28.507±1.768^★       24.471±0.647^★

HK         8         26.716±1.625^▲#      23.120±0.754^▲#

注: 与BK相比：^△P＜0.05;与MK相比: ^*P＜0.05 与SK相比: ^★P＞0.05;与 SK相比: ^▲P＜0.05;与LK相比: ^#P＜0.05.

 

表 2 大鼠结肠粘膜NO 和NOS 活性

group         n         NO(μmol/gprot)         NOS(U/mgprot)

 BK          8        0.545±0.985          0.486±0.064

 MK           8        1.119±0.673^△          1.216±0.123^△

 SK           8        1.006±0.651^▲          1.198±0.189^▲

 LK           8        1.105±0.276^★          1.182±0.847 ^★

 HK           8        0.902±0.584^*#          1.076±0.172^*#

注: 与BK相比: ^△P＜0.05；与 MK相比: ^*P＜0.05；与MK相比: ^★P＞0.05;与MK相比: ^▲P＞0.05；与SK相比: ^#P＜0.05

 

讨    论

 

溃疡性结肠炎（UC）是一种发生于结肠粘膜的慢性非特异性炎性疾病。其病因和发病机制尚不十分清楚，目前许多研究表明其发病机制与环境的激发因素、遗传易感性、感染因素及免疫介导的组织损伤等因素有关^[1-6]。NO是一种相对稳定的气体自由基，在胃肠道内广泛分布，参与胃肠道的运动，胃肠道粘膜的保护和炎症反应^[8]，在机体许多生理、病理过程中起着关键作用。NOS是合成NO的关键限速酶，当体内存在细胞因子和内毒素等刺激因素时，iNOS就能生成大量的NO^[9]。

NOS在全肠壁均有分布，其中以肠道肌层、粘膜下层最为丰富，正常人群结肠粘膜层既有cNOS,又有iNOS。在UC患者结肠粘膜层主要以iNOS为主，其在粘膜层血管内皮细胞及平滑肌细胞内也有分布^[10]。Mourelle^[11]研究也发现在UC患者急性发作期，结肠粘膜上皮细胞中的iNOS异常活跃。另有研究表明，在UC病变的肠粘膜中，iNOS的活性增高及NO含量的增加与肠道炎症程度呈平行关系^[12]。在炎症进展期，iNOS产生大量的NO，一方面通过伴随产生的自由基损伤组织，另一方面激活机体免疫杀伤细胞活性，并通过增强细胞毒性作用，从而造成组织的损伤^[13]。

本实验结果显示，UC大鼠血液及结肠粘膜中NO含量及NOS活性较对照组相比，均明显升高，提示大鼠血液及结肠粘膜中NO含量升高及NOS的活性增强与UC密切相关。经泄浊解毒方治疗后，UC大鼠血液及结肠粘膜中NO含量及NOS活性均降低，其中泄浊解毒方大剂量组效果最为明显。提示泄浊解毒方治疗UC的作用机制可能是：通过降低UC大鼠病变的肠粘膜中及血液中NOS活性，限制NO的合成，下调UC大鼠血液及结肠粘膜中NO含量。阻断因大量的NO，与伴随NO产生的自由基共同作用，引起组织细胞的氧化损伤和坏死、激活机体免疫杀伤细胞活性，并通过增强细胞毒性作用，造成组织的损伤的过程，从而达到治疗目的。

 

参考文献

 

[1] Loftus EV . Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: Incide- nce, prevalence, and environmental influences. Gastroenterology 2004;126: 1504～1517

[2] Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel disease: role in pathogenesis and clinical implications. In: Eds Sartor RB and Sandborn WJ. Kirsner’s Inflammatory Bowel Diseases. Philadelphia: Elsevier, 2004: 138～162

[3] Mow WS, Vasiliauskas EA, Lin YC, et al. Association of antibody responses to microbial antigens and complications of small bowel Crohn"s disease.Gastroenterology 2004,126: 414～424

[4] Schreiber S, Rosenstiel P, Albrecht M, et al. Genetics of Crohn disease, an archetypal inflammatory barrier disease. Nat Rev Genet 2005, 6: 376～388

[5] Newman B, Siminovitch KA. Recent advances in the genetics of inflam- matory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol 2005, 21: 401～407

[6] Sartor RB, Hoentjen F. Proinfl ammatory cytokines and signaling pathways in intestinal innate immunecells, in Mucosal Immunology, J. Mestecky, M.E.Lamm, J.R. McGhee, J. Bienenstock, L. Mayer, and W. Strober, Editors. 2005, Elsevier Academic Press:London, 681～701

[7] Pavlick KP, Laroux FS, Fuseler J, et al. Role of reactivemetabolites of oxygen and nitrogen in infl amatory bowel disease. Free Radic Biol Med, 2002,33: 311～322

[8] 陈主初.病理生理学[M].北京:人民卫生出版社,2001,83

[9] Konturek PC, Brzozowski T, Engel M, et al. Ghrelin ameliorates colonic infl ammation. Role of nitric oxide and sensory nerves. J Physiol Pharmacol ,2009,60: 41～47

[10] 陈吉.一氧化氮与溃疡性结肠炎[J].国外医学内科学分册,1996,23(8):323～325

[11]Mourelle M.Expression of inducible nitric oxide synthase activity in human colon epithelial cells:modulation by Tlymphocyte derived cytokines[J].Gut,1998,43(1):56～63

[12]Boughon-smith NK,Evans SM,Hawkey CL,et al.Nitric oxide synthase activity in ulcerative colitis and crohns disease[J]. Lanct,1993,342 (8866):338～340

[13]Moncada S,Palmer RMJ,Hidds EA.Pharmacol Rev. 1991, 43(2): 109 -141