郭智,谭晓华,陈丰.中华实用诊断与治疗杂志,2009,10

细胞因子诱导的杀伤细胞治疗难治性淋巴瘤的临床研究

 

   郭智¹，谭晓华¹，陈霞¹，石宇杰¹，张明²，张育葵³，胡碧川³，纪妍⁴，瞿嵘⁴北京军区总医院血液科郭智

1.北京军区总医院血液科，北京市100700；2.湖北武汉中山医院3.湖北襄樊中医院4.广东惠州中心医院

 

[摘要]  目的: 探讨细胞因子诱导的杀伤细胞在难治性淋巴瘤患者中的应用及临床效果。方法：以8例难治性淋巴瘤患者作为研究对象，通过血细胞分离机采集外周血单个核细胞，培养和扩增CIK细胞后回输至难治性淋巴瘤患者体内，来评价疗效。结果: CIK治疗后患者自觉症状改善，通过影像学复查，其中1例多发侵犯治疗后肿块基本消失，其它7例肿块大小均有不同程度的缩小，T细胞亚群水平在回输后均有明显提升。结论: CIK治疗难治性淋巴瘤患者可改善生活质量、副作用小及较好的临床效果，为难治性淋巴瘤提供了一种新的治疗方案。

[关键词] 细胞因子诱导的杀伤细胞；难治性淋巴瘤；免疫治疗

 

Clinical study on treatment of refractory lymphoma with cytokine induced killer

Guo Zhi,Tan Xiaohua,Chen Xia,et al.Department of Hematology,General Hospital ,Beijing Military Area , Beijing 100700,China

[Abstract] objective：Discussion cytokine induced killer in refractory lymphoma patients and clinical effect.Methods：8 patients with refractory lymphoma patients studied by collecting blood cell separator peripheral blood mononuclear cells, culture and expansion of CIK cells after the transfusion to patients with refractory lymphoma, the uation of the effect.Results：CIK after treatment in patients with symptoms improved through the imaging review, including 1 case of multiple violations of the tumor disappeared after treatment, the other 7 cases of varying degrees tumor size reduction, T cell subsets in the level of post-transfusion are obvious Upgrade.Conclusion：CIK in the treatment of refractory lymphoma patients can improve the quality of life, side effects and better clinical results for refractory lymphoma provides a new treatment program.

[Key word] Cytokine induced killer；refractory lymphoma；immunotherapy

 

淋巴瘤(ML)是一组起源于淋巴结或结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，是对放化疗较敏感的肿瘤。由于目前综合治疗的合理应用，60％的霍奇金淋巴瘤(HL)和30～50％的非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者可以获得治愈或长期无病生存^[1]，然而其中一部分淋巴瘤患者会变为难治性或复发进展，最终死于肿瘤^[2]。难治性淋巴瘤一般定义为常用化疗方案治疗2周期以上无效，或退缩后很快复发者，虽然自体造血干细胞移植在治疗难治性淋巴瘤显示了肯定疗效^[3]，但有限的适应范围和经济承受能力限制了它们的广泛应用，所以难治性淋巴瘤治疗仍然是目前治疗的难点^[4]。

目前以免疫效应细胞为核心的过继细胞免疫治疗是肿瘤免疫治疗的热点，大量的研究表明应用前景最为广阔的就是细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞^[5]。CIK是从外周血、骨髓或脐血中分离出单个核细胞,经过一定时间细胞因子诱导刺激培养而获得的免疫活性细胞^[6]，以CD3⁺CD56⁺T细胞为主要效应细胞的异质细胞群，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感,来发挥很强的生物学效应^[7]，并且对正常骨髓造血细胞毒性小、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞等优点而受到广泛关注^[8]。CIK细胞的培养体系中，各细胞因子均可以促进细胞增殖或协同作用增加细胞的细胞毒作用，机体内含量很少的CD3⁺CD56⁺细胞在体外培养2～3周时可大量扩增，扩增倍数可达几十倍甚至上百倍，具有很强的抗多种肿瘤系的功能^[9]，是目前最新、疗效最好的肿瘤免疫治疗手段。为探讨CIK治疗难治性淋巴瘤的疗效，我们通过CIK细胞体外培养的方法，初步应用于8例晚期难治性淋巴瘤的治疗，并体会如下。

1  材料与方法

1.1  病例资料  8例病例均为北京军区总医院血液科(2003年1月至2007年9月)收治的经病理确诊为ML的患者，都为男性，年龄分别为22、26、36、39、41、45、55、65岁，平均年龄41岁，其中HL 2例，NHL 6例，发病初期均有至少2-3个以上结外器官侵犯，ABVD、CHOP、MINI、ESHAP、DICE、VIP等方案化疗至少6-10次以上，均未见明显缓解，其中3例使用过美罗华单用或联用至少4个疗程，4例治疗前出现过胸水、腹水，经病理证明为淋巴瘤细胞浸润，除了弥漫大B型1例，其余7例均有骨髓浸润，其中1例间变大细胞型胸壁及肩胛骨处有大于10cm的肿块。所有8例患者均对化疗明显耐药，且一般情况均较差，耐受性也差，多次化疗后，骨髓干细胞受损明显，但肿块却快速生长，中途曾采用通过大剂量化疗或放疗来克服耐药或逆转耐药均未见效果，且因为众多原因无法进行造血干细胞移植。(见表1)

表1  患者一般资料

编号 年龄 性别 体能 病理分型     分期    结外侵犯   大肿块     化疗过程          其它治疗  疗效  病程

            (ECOG评分)                               (>10cm)

1     22    男    0  HL混合细胞  ⅣB    肺脾骨髓      无     ABVD*6 MOPP*3        干扰素    NR    18m

2     26    男    1  HL结节硬化  ⅣB   肺胸腹壁骨髓   无     ABVD*4 MOPP*3        放疗      NR    16m 

3     36    男    1  NHL弥漫大B  ⅣA   肝脾胰骨髓     无     CHOP*3 DICE*3        美罗华    NR    10m

4     39    男    2  NHL间变大T  ⅣB   肝脾胸腹壁骨髓 无  CHOP*3 CHOEP*3 DICE*2   放疗      NR    12m

5     41    男    1  NHL脾边缘区 ⅣB  肝脾胰胸壁骨髓  无  CHOP*5 ESHAP*3 DICE*3   美罗华    NR    35m

6     45    男    0  NHL弥漫大B  ⅣB      肺肝        无  CHOP*3 ESHAP*2 DICE*1   干扰素    NR    12m

7     55    男    4  NHL间变大B  ⅣB  肺胸腹壁骨髓皮肤 有  BCHOP*3 ESHAP*2 DICE*2  放疗      NR    13m

8     65    男    3  NHL套细胞   ⅣA      肺胰肝骨髓     无      CHOP*3 DICE*3       美罗华    NR    12m

1.2  临床疗效观察指标  主要包括：①T细胞亚群的测定：在采有核细胞时及CIK细胞回输前、回输后的1周左右进行Ｔ细胞亚群的测定②影像学指标：治疗前及治疗后1月左右均进行了PETCT(正电子发射计算机断层显像仪/CT的全身肿瘤显像)或ECT(同位素发射计算机辅助断层显像)或CT来检查复查对比③骨髓象检查：对有骨髓浸润患者治疗后复查骨髓④血常规、生化等常规检查及不良反应随时观察监测。

1.3  CIK细胞培养后的回输  于CIK治疗前两周左右开始经CS-3000血细胞分离机循环患者血液5-6L采集有核细胞，在符合GMP的实验室条件下，用无血清培养基调整细胞浓度，在培养中不同时间加入不同的细胞因子进行培养，同时进行细胞计数和表型分析，调整细胞浓度，补充IL-2。每例患者的CIK细胞培养过程中均进行细菌、真菌和支原体检测，由本院临床检验中心进行检测，所有样本检测结果均为阴性，回输时用生理盐水配成100ml，2-3天回输1次，分3-4次输完，每次回输细胞数计数在10⁹以上，输完后均给予小牛血去蛋白提取物营养细胞，同时补液2000ml以上，回输前均经过菌检及培养，确保了细胞培养及回输的安全。

1.4  CIK治疗方法  每疗程回输CIK细胞2-5次，每次回输细胞数不低于1*10⁹，每疗程回输细胞总数>5*10⁹。CIK细胞静脉回输治疗前30min给患者口服消炎痛25mg或肌肉注射非那根25mg预防不良反应，细胞回输前先静脉滴注生理盐水，确保输液管道畅通，然后连接细胞悬液滴瓶回输细胞，2h内输完。CIK细胞重复治疗首先要决定于患者的经济情况，若条件许可，第一年以每三到六个月重复一个疗程为佳，第二年每半年重复一个疗程，以后每年重复一个疗程，每个疗程输入的CIK细胞量一般为5-15*10⁹。

1.5  疗效评定标准  依照张之南教授主编的《血液病诊断及疗效标准》的国内标准^[10]，评价疗效为：完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR)、进展(PD)；主要疗效指标为：影像学指标（CT/ECT/PETCT等）；次要疗效指标包括：①T淋巴细胞亚群② 其他生化、LDH、血象变化③骨髓形态学检查④临床症状改善情况；安全性指标包括①不良反应发生率②死亡率③并发症发生率。

2  结 果

2.1 治疗效果   监测T细胞亚群，8个患者外周血中CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞比例在CIK细胞回输后均有明显提升。复查骨髓象，1例患者骨髓淋巴瘤细胞从16%(脾边缘区型)获完全缓解，另6例骨髓淋巴瘤细胞均有减少。所有8例患者复查PETCT/ECT/CT后，1例(脾边缘区型)发现纵隔、肝、脾、胰尾、腹主动脉、骨髓等处多发侵犯提示治疗前后肿块基本消失，另2例(弥漫大B型1例、混合细胞型1例) 也显示纵隔、肺、肝、脾等处侵犯明显改善，其它5例均显示肿瘤有不同程度的缩小。回输前后的肝肾功能、凝血、血常规等检查测定后未发现CIK细胞对其有明显损害作用，同时从CIK细胞治疗前后的不良反应监测说明了自体CIK细胞治疗具有很好的安全性。CIK细胞回输后，患者外周血中免疫活性细胞的比例明显提高，可以明显改善患者体能状态，提高机体整体免疫功能，达到有效抗肿瘤的目的。(见图1、表2、表3)

 

     

 

 

 

 

 

图1  CIK细胞治疗后局部侵犯部位完全消失

 

表2  患者CIK治疗的一般情况 

编号 年龄 性别 体能  结外侵犯部位  大肿块每疗程CIK治疗次数  总细胞记数 疗程数 疗效

              (治疗后)    (治疗后)       (治疗后)   (每次细胞记数10⁹)       (10⁹)

1    22  男       0         无            无      3次（6、8、4）         18           1      PR

2    26  男       0     肺、胸腹壁、骨髓  无      3次（5、5、3）         13           1      PR

3    36  男       0     肝、骨髓          无      3次（5、6、5）         16           1      PR

4    39  男       0     肝、脾、胸腹壁    无      3次（3、8、3）         14           1      PR

5    41  男       0          无           无      4次（2、8、1、2）      13           1      CR

6    45  男       0          无           无      3次（3、3、1）         7            1      PR

7    55  男       2      胸腹壁、骨髓     无      4次（3、3、4、2）      12           1      PR

8    65  男       1      胰、肝、骨髓     无      2次（6、3）            9            1      PR

 

表3  CIK细胞治疗前后平均淋巴细胞亚群的对照

CD3⁺       CD4⁺       CD8⁺        CD4⁺/CD8⁺  

治疗前          61.8±5.6   28.1±5.2    30.0±9.5       0.8±0.5   

治疗后          69.8±6.2   32.1±5.6    32.5±11.5      1.0±0.4

注:与回输治疗前相比有提高   (P<0.05 )

 

2.2  CIK细胞回输后的不良反应情况   CIK细胞回输过程中及回输之后，8例患者均存在不同程度的发热，一般在回输后1～2h出现，持续时间大部分在8～15h，体温约在38℃左右，治疗后一周左右也存在持续低热，均给予了解热镇痛药退热，考虑为代谢废物综合征表现，有1例患者出现头痛、恶心、呕吐，2例患者出现烦躁，暂停治疗后消失，能坚持治疗至结束，所有患者均未出现皮肤过敏、瘙痒、心动过速、肝肾衰竭等其他不良反应。

2.3  并发症及临床症状变化分析   未见任何明显并发症发生事件，CIK细胞回输治疗后多数患者自觉症状改善，其它生活指标，如睡眠、体力、食欲等均有不同程度的改善，后期副反应无，这些表明CIK治疗对于提高患者生活质量具有积极的意义。

3  讨  论

3.1  CIK治疗难治性淋巴瘤的理论基础   CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养后获得的一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T细胞，对多重耐药的肿瘤细胞同样敏感并能抵抗肿瘤细胞引发的调亡，而不影响骨髓造血功能^[11]。目前研究认为CIK细胞的杀瘤机制有^[12]：①细胞表面粘附因子如淋巴细胞功能相关抗原-1及细胞间粘附分子-1在效应细胞识别靶细胞中发挥重要作用②CD3⁺ CD56⁺ 细胞可释放大量的具有细胞毒性的胞浆颗粒而对靶细胞发挥溶细胞作用③CIK细胞活化后分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF、IL-2等，不仅对肿瘤有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。此外CIK细胞还可以诱导肿瘤细胞调亡,同时CIK细胞自身还能分泌IL-2、IL-6、TNF和GM-CSF等细胞因子提高细胞毒性或者调节肿瘤细胞对CIK细胞的敏感性^[13]。

3.2  T细胞亚群检测的意义  T细胞亚群是反映人体免疫功能的重要指标^[14]，我们通过检测患者治疗前后T细胞亚群的变化，可以反映CIK治疗对机体免疫功能的影响。检测结果表明，自体CIK细胞治疗可以明显提高CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺ T细胞的比例，这对于经常规治疗后免疫功能极其低下的肿瘤患者来说具有重要意义。此外8例患者中的多数患者食欲、睡眠等均有改善，表明经CIK细胞治疗后大多数患者的生活质量明显改善，目前这些患者病情稳定，但自体CIK治疗的远期疗效及其对患者生存期的影响仍需长期连续随访。

3.3  影像学检查的重要意义  众所周知ML结外多系统侵犯因其部位和生长方式的不同而具有相对特异的影像学表现，因此，合理的影像学检查是确定淋巴瘤存在、分期、范围、治疗效果以及随访观察的主要手段，在影像学检查手段中^[15]，X线检查(包括胸腹片、体层和造影检查)是评价胸部、骨骼和腹部淋巴瘤的基本方法，胃肠钡剂造影是检查胃肠道淋巴瘤的主要方法，CT扫描是胸部、腹部、盆腔淋巴瘤的常用检查方法，其重复性好，空间分辨率较优，是淋巴瘤分期的基本方法，B超扫描能检出肝、脾、腹膜后淋巴结及消化道壁浸润增厚等病变，可灵活地作任何切面的扫描，但其准确性易受操作者的技术及责任心影响不利于对比。PETCT具有PET和CT两种功能，既能反映组织细胞代谢，较早发现病灶，又能对PET所发现的病灶准确定位，提供CT的信息，二者互补，可使诊断准确性明显提高^[15]，是ML患者分期、复查、评价疗效、随访等最好的影像学检查。

3.4  自体CIK细胞治疗肿瘤的安全性评价   医疗安全是医院的生命线，病人在接受一种新的治疗手段时，首先考虑的是它的安全性问题，然后才是其有效性，CIK细胞治疗肿瘤是一种新的治疗肿瘤的方法，属生物治疗的一种，所以开展有关细胞治疗疾病的项目首先必须建立符合GMP要求的实验室，参与细胞处理过程的医务人员必须遵循此规则^[17]。我们在CIK细胞培养及临床治疗过程中严格注意质量控制，每例患者的CIK细胞培养过程中均进行多次细菌、真菌和支原体检测，由本院临床检验中心和本实验室同时检测，所有结果均为阴性，确保了细胞培养和细胞回输的安全。培养的CIK细胞达到质量标准后，将细胞重悬于IL-2和人血白蛋白的生理盐水中制成细胞悬液后立即回输给患者，能保持细胞悬液的高度稳定，不会对质量产生影响。因此，CIK治疗是一种生物疗法，它对患者几乎没有副作用，只要严格按照GMP标准操作，按其临床适应证选择病人，临床应用是安全可靠的。

4  问题与展望

尽管对CIK的特性、分离培养及分化等已有大量研究，但距离广泛临床应用还有较长的路要走，仍有许多相关技术难点需要解决：如何寻找获得足够数量CIK的最佳途径来满足临床应用的要求？哪种CIK细胞来源为最佳选择？CIK细胞应用的剂量及回输途径怎样才能取得最佳效果？人体哪些因素影响CIK细胞的发挥作用？什么样的情况可以增强或减弱CIK细胞的影响？怎样建立CIK过继免疫治疗的统一方案？如何寻找联合应用的最好组合来提高生物治疗的杀伤力及特异性,发挥最佳功能需要等等。这些都需要我们更加深入的探索和多方面的研究。

恶性肿瘤的生物治疗经历了一个漫长而又令人失望的曲折过程，CIK治疗的出现的确带来了许多新的意义，CIK治疗的临床应用人员必须对CIK的基础理论有明确的认识，并在保证安全性的基础上进行大量严格的临床验证。本研究只是我们对CIK治疗难治性淋巴瘤的初步尝试，其中所用方法及所做结论尚待进一步证实及完善，在血液肿瘤的CIK治疗领域的临床研究才刚刚起步。作者坚信CIK临床应用具有良好的前景，它必将为血液肿瘤的治疗开辟一条崭新途径！

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