郭智.临床荟萃.2009，7

细胞因子诱导的杀伤细胞在血液肿瘤中的治疗进展

                             郭智北京军区总医院血液科郭智

             北京军区总医院血液科（北京  100700）

 

关键词：细胞因子诱导的杀伤细胞；血液肿瘤

 

细胞免疫治疗作为恶性肿瘤放化疗后的辅助手段已经得到较多的临床应用，对于促进患者免疫系统重建、消除残留病变及骨髓净化都具有良好效果。既往一些免疫治疗的方法如淋巴因子激活的杀伤细胞等已成功应用于某些肿瘤的临床治疗，但存在体外增殖数量少、不良反应大、效果不佳等缺点，限制了其推广应用^[1]。1986年Schmidt RE^[2]和Lanier LL^[3]先后自外周血中诱导出CD3⁺CD56⁺细胞，1991年Schmidt-Wolf等^[4]报道了具有高增殖能力和高细胞活性的细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞，它是将人外周血或骨髓单个核细胞在体外用多种细胞因子与CD3单抗共同培养2-3周后获得的一组异质细胞，同时表达CD3⁺和CD56⁺,也称自然杀伤细胞样T淋巴细胞，它具有T细胞的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性抗原复合体（MHC）限制性杀瘤特点，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感,来发挥很强的生物学效应^[5]。CIK是一类新型抗肿瘤效应细胞,能在体外被诱导并大量增殖,与以往报告的一些抗肿瘤效应细胞相比其杀瘤活性更强、杀瘤谱更广，是目前恶性血液病细胞免疫治疗中最具前景的细胞之一，现仅就CIK细胞的特性及在恶性血液病中临床应用综述如下。

1 CIK细胞的来源及制备方法

CIK细胞是人血液或骨髓的单个核细胞在体外经与多种细胞因子和CD3单抗共同培养获得，其单个核细胞可以有不同的来源,包括白血病患者的骨髓或外周血单个核细胞、健康供者的外周血单个核细胞和脐血单个核细胞。CIK细胞的目前诱导的方法有多种，主要区别在于细胞因子的组合不同，白细胞分化抗原3单抗（CD3 mAb）和干扰素-γ（IFN-γ）是必要的组分，CD3 mAb起到丝裂原活性的作用，可以与T细胞表面的CD3交联，诱导细胞活化,而IFN-γ可以诱导白细胞介素1（IL-1）等细胞因子的合成，其他的细胞因子尚有IL-1、IL-2、IL-7、IL-12等。目前多数实验室均采用IFN-γ、CD3 mAb和IL-2联合应用制备CIK细胞^[6]，CIK细胞应用于临床一方面要保证足够的数量，另一方面要保证CIK细胞较强的生物学活性和减少感染的机会。

2 CIK细胞的杀瘤特点

主要有如下几点^[7]：①CIK细胞增殖速度快，培养22天后CD3⁺CD56⁺的CIK细胞绝对数量能提高到1000倍；②杀伤肿瘤细胞效率高，大量体内外实验证明CIK细胞比淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞杀瘤的活性强；③CIK细胞在识别和杀灭靶细胞时是非MHC-限制性的，杀瘤范围广；④对多耐药的肿瘤细胞同样敏感；⑤杀瘤活性不受免疫抑制剂如CsA、FK506的影响；⑥对正常骨髓造血前体细胞影响较小；⑦能抵抗肿瘤细胞引起的Fas-FasL调亡。

3 CIK在白血病的应用研究

现在研究较多的CIK细胞在白血病中的效应，主要针对白血病干祖细胞的杀伤作用，作用机制认为可能是由于白血病前体细胞表面分子表达下调或与结合的多肽发生变异，导致CIK细胞对其识别,产生细胞毒作用，而CIK细胞分泌的INF、TNF等细胞因子，对白血病干细胞杀伤起到重要作用^[8]。

国内的惠吴函等^[9]通过采集5例慢性期慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血标本在体外诱导培养细胞，流式细胞仪(FCM)检测其表型，G带法检测CIK细胞核型，分选CD34⁺CML白血病细胞，染色后利用FCM检测CIK细胞对G₀期CD34⁺CML白血病细胞的杀伤作用。发现CIK细胞可从患者外周血中大量扩增,来源于正常淋巴细胞，对G₀期CD34⁺白血病细胞有明显抑制作用，对正常造血前体细胞无抑制作用，可作为过继细胞免疫治疗的效应细胞治疗CML。

张乐萍等^[10]通过PCR法扩增TCRδ及IgH基因重排检测急性淋巴细胞白血病（ALL）患者微小残留病（MRD），对28例儿童ALL化疗12个月以上MRD仍阳性者中14例予CIK/IL-2输注治疗为治疗组,余为对照组。发现对照组14例中8例复发，6例MRD转阴，并长期生存；治疗组MRD均转阴，中位随访期18个月未见复发，为CIK/IL-2联合治疗具有清除MRD、减少儿童ALL复发的作用。

童春容等^[11]对37例急性白血病患者进行了58疗程输注CIK细胞治疗。其中34例血液学缓解期接受CIK治疗的3年持续完全缓解率为75%，经CIK治疗后的中位生存期为26个月（1-59月），经l疗程CIK治疗后,2例(2/3)肿大的脾明显缩小，均生存至今；8例(8/8)骨髓残留的异常染色体和/或基因标志消失。

国外的Linn等^[12]采集了21例急性髓性白血病（AML）患者和8例ALL患者的骨髓标本，并对来源于这些标本且具有抗白血病活性的CIK细胞进行了细胞特性及细胞溶解活性研究。发现CIK细胞可在患者的含有高浓度的白血病原始细胞的单个核细胞标本中生长并繁殖，这些细胞可以杀死人类NK细胞的靶细胞K562细胞，并观察到该CIK效应细胞能够溶解AML自体靶细胞，并且能够产生抗异体白血病原始细胞的细胞毒作用，该研究提示，CIK细胞在AML的细胞免疫治疗、AML的残留病灶、异基因移植后供体淋巴细胞输注和化疗复发的患者具有广泛的应用价值。

Scheffold等^[13]将CML患者的外周血淋巴细胞制成CIK细胞，该CIK细胞对自体和异体的CML肿瘤细胞都有明显的杀伤活性。

Christine等^[14]从13名CML患者的外周血单个核细胞中扩增出CD3⁺ CD56⁺ 的CIK细胞群。其中4名患者的CIK细胞可以抑制自体CML原始细胞的克隆生长，该研究同时显示来自正常供者的异体CIK细胞也可以抑制CML的克隆生长。在培养开始时细胞遗传学检测均为Ph（+），至培养的第21～28天患者Ph（-）。这提示恶性细胞在CIK培养的条件下死亡了，它表明Ph（+）的前体细胞在理想的培养条件下被净化了。

Hongen等^[15]将CIK细胞用于儿童白血病，发现CIK细胞尤其对大剂量化疗后和干细胞移植后的“残余白血病”患儿效果显著。

4 CIK在淋巴瘤、骨髓瘤等其他血液肿瘤中的应用研究

CIK在实体瘤治疗方面目前已经较为广泛^[16-18]，国内的相关报道很多，一般都认为CIK细胞过继免疫疗法能明显提高实体瘤患者免疫功能,改善临床症状，延长生存期，且无不良反应，还能显著提高患者外周血T淋巴细胞亚群，影像学复查后发现肿块能有一定程度的缩小。CIK细胞治疗在除白血病以外的其他血液肿瘤中主要为淋巴瘤、多发性骨髓瘤（MM）上的相关治疗。

国内的郭智^[19]等通过CS-3000血细胞分离机循环患者血液5-6L采集有核细胞后培养扩增获得CIK细胞后，对5例经病理确诊为非霍奇金淋巴瘤（NHL）且存在化疗耐药、多处结外器官侵犯的患者进行CIK治疗并观察治疗前后侵犯部位肿块的变化，发现所有患者通过影像学复查显示肿瘤明显缩小，2例多发侵犯性患者治疗前后显示完全消失，他认为CIK细胞治疗耐药性NHL安全有效，为耐药性NHL的治疗提供了1种新的有效的免疫治疗手段。

石永进等^[20]应用自体CIK细胞对5名恶性血液系统肿瘤患者进行治疗，包括MM2例、NHL1例、急性早幼粒细胞白血病（APL）1例、AML- M4 1例。自体CIK细胞的回输总量在1.6×10¹⁰ 以上，分2～3次回输，回输时患者未出现明显毒副反应，回输后进行心、肝、肾等器官功能检测未出现新的异常。随访22～26个月，其中APL患者CIK治疗前PML-RARα融合基因为阳性，CIK回输后转为阴性，2年后检查仍为阴性，除AML-M4患者复发外，其他患者均未见复发。

国外Leemhuis等^[21]对7例NHL、2例HL自体移植复发的患者进行CIK临床治疗，经过IFN-γ、IL-2、CD3单抗联合培养21天后，细胞记数范围在1*10⁹-1*10¹⁰，CIK治疗后所有患者没有明显不良反应，2例出现部分反应，2例基本缓解，1例治疗后生存周期超过18个月，他们认为CIK治疗自体移植对于复发的高危淋巴瘤患者有明显效果。

Marten A等^[22]应用自体CIK细胞对MM进行免疫治疗的试验研究，CIK的增殖达到一个最佳的标准，发现CIK细胞能够溶解MM细胞，这种效果明显提高了抗肿瘤的效应，可用于临床治疗。

5 结论与展望

作为恶性血液病细胞免疫治疗中最具前景的CIK细胞治疗，临床应用目前已经日益广泛，一般认为CIK细胞对靶细胞的杀伤原理Bela等^[23]认为如下，通过两条途径:一是CIK细胞被淋巴细胞功能相关抗原有关识别机构激活，导致胞浆毒性颗粒依赖性的溶细胞作用，这条途径与胞浆内环磷酸腺苷（CAMP）浓度无关;二是CIK细胞表面的CD3样受体被结合，而激活CIK细胞产生胞浆毒性颗粒介导的溶细胞作用，这条途径与胞浆内CAMP水平有关。

CIK细胞因其高增殖活性，使其成为现阶段细胞免疫治疗中最具应用价值的方法之一，在恶性血液病中更有着其深远的治疗意义，CIK细胞杀瘤抑瘤作用不仅在实验室得以证实，而且已经逐步应用临床，成为新一代肿瘤过继免疫治疗的主力军，尽管有着广阔研究前景，但还存在很多有待解决的问题，如①寻找获得足够数量CIK的最佳途径以满足临床应用要求②探讨CIK细胞应用剂量及回输途径等③建立过继免疫治疗的统一方案④寻找联合应用最好组合来提高杀伤力及特异性,发挥最佳功能需要^[24]等等…这些都需要我们更加深入的探索和多方面的研究。

综上所述，CIK在血液肿瘤中的治疗有着广泛的前途，对于血液肿瘤患者在标准化疗结束后或有MDR的患者均可以使用CIK细胞作为免疫治疗，CIK细胞也可能有望应用于不适宜做化疗的血液肿瘤患者，但确定其疗效仍需要进行长时间大样本的随机对照临床试验。

 

参考文献:

[1] Ming Shi,Bing Zhang,Zi-Rong Tang,et al.Autologous cytokine-inducedKiller cell therapy in clinical trial phase I is safe in patients with primary hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterology,2004,10(8):1146

[2] Schmidt RE,Murray C,Daley JF Sehlossman SF Ritz J.A subset of natural killer cells in peripheral blood displays a mature T cell phenotype[J].J Exp Med,1986,164(1):351-356

[3] Lanier LL,Le AM,Civin CI,et al.The relationship of CDl6(Leu-11) and Leu-19(NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes[J].J Immunol,1986,136(12):4480-4486

[4] Schmidt-Wolf IG,Negrin R S,Kiem H P,et al.Use of a SCID mouse.human lymphoma model to uate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1):139-149

[5]Brandau S,Bohle A.Activation of natural killer cells by Bacillus Calmette-Guerin[J].Eur Urol,2001,39(5):518

[6]Blattman JN,Greenberg PD.Cancer immunotherapy:a treatment for the masses[J].Science,2004,305:200-205

[7] 于津浦,任秀宝.ClK细胞肿瘤过继免疫治疗的新希望[J].中国肿瘤临床, 2001,28(7):557-560

[8] Schmidt-Wolf IG,Negrin RS,Kiem HP,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to uate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1):139-149

[9] 惠吴函,徐娟,万岁桂,等.CIK细胞对慢性粒细胞白血病G0期CD34+白血病细胞的杀伤作用[J].肿瘤防治杂志,2005,15(12):1160-1163

[10] 张乐萍,陆爱东,童春容,等.白细胞介素2治疗儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病灶疗效观察[J].实用儿科临床杂志,2003,18(3):185-186

[11] 童春容,耿彦彪,陆道培.自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗急性白血病的临床研究[J].北京医科大学学报,2000,2(5):473-477

[12] Linn Y C,Hui K M.Cytokine-induced killer cells:NK-like T cells with cytotolytic specificity against leukemia[J].Leuk Lymphoma,2003,44(9):1457-1462

[13] Scheffold C,Brandt K,ohnston V,et al.Potential of autolo-gous immunologic effector cells for bone marrow purging in patients with chronic myeloid leukemia[J].Bone Marrow Transplantation, 1995,15(1):33-39

[14]Christine H,Charles D B,Pearl C,et al.Expansion of philadel-phia chromosome-negative CD3⁺CD56⁺ cytotoxic cells from chronic myeloid leukemia patients:In vitro and in vivo efficacy in severe combined immunod-eficiency disease Mice[J].Blood,1998,92(9):3318-3327

[15] Hongen S,Petrises S,Worapongpaiboon S,et al.Generation of CD3⁺CD56⁺ cytokine induced killer cells and their in vitro cytotoxicity against pediatric cancer cells[J].Int J Hematol,2003,77(2):175-179

[16] 司徒杰,高新,湛海伦,等.CIK细胞免疫疗法在肾癌治疗中的应用[J].白求恩军医学院学报,2005,4(3):215-216

[17] 张南征,徐永茂,陈复兴,等.CIK细胞治疗中晚期肝细胞肝癌的临床研究[J].东南国防医药,2006,2(8):84-87

[18] 张才擎,张嵩,王红梅.肺癌患者胸水来源树突状细胞增强CIK细胞的杀伤作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志, 2006,2(13):142-143

[19] 郭智,谭晓华,高锦,等.CIK治疗耐药性非霍奇金淋巴瘤疗效观察[J],实用癌症杂志,2006,1(21):15-16

[20] 石永进,虞积仁,朱平,等.细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞的大容量扩增与杀伤活性观察[J].生物医学工程学杂志,2001,18(1):94-96

[21] Leemhuis T,Wells S,Scheffold C,et al.A phase I trial of autologous cytokine induced killer cells for the treatment of relapsed Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma[J].Biol Blood Marrow Transplant, 2005,11(3):181-187

[22] Marten A,Renoth S,von Lilienfeld-Toal M,et al. Expansion of cytotoxic CD3⁺CD56⁺ cells from peripheral blood progenitor cells of patients undergoing autologous hematopoietic cell transplantation[J].Biol Blood Marrow Transplant,2001,7(4):216-222

[23] Bela am,Schmidt-Wolf G H,Weissman I L,et al.Two pathways of exocytosis of cytoplasmic granule cotents and target cell killing by cytokine-induced CD3⁺CD56⁺ killer cells[J].Blood,1995,86(9):3493-3499

[24]单保恩.肿瘤的细胞因子和细胞因子基因治疗[J],临床荟萃,2003,22(18):1319-1320