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- 宫念樵主任医师
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华中科技大学同济医学院附属同济医院
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器官移植
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- 肝脏移植后丝裂素活化蛋白激酶级联途径与肝细胞抗应激反应
- 作者:宫念樵|发布时间:2009-04-24|浏览量:377次
宫念樵 张伟杰 李国逊 郭晖 叶启发
【摘要】 目的 探讨肝脏移植后丝裂素活化蛋白激酶级联途径与抗应激反应的具体变化 方法 将标本按病理表现分为三组:A(对照)组10例、B(无排斥反应)组10例、C(急性排斥反应)组8例。每例标本行MAPK、Ras、Jun、HSP70蛋白检测和Ras、HSP70 mRNA表达水平检测。结果 MAPK、Ras、Jun 蛋白表达在A、 B和C组依次增高, HSP70蛋白表达在B组最高,C组较B组有下降,Ras、HSP70 mRNA表达与蛋白表达呈现同步性。结论 肝脏移植后肝细胞MAPK级联途径与抗应激反应发生变化,体现出肝细胞自我修复和保护效应。这种精细的调节机制对维持个体存活有积极意义。武汉同济医院器官移植外科宫念樵
【关键词】 肝脏移植; MAPK级联途径;抗应激反应
MAPK cascade pathway and anti-stress response of hepatocyte after liver transplantation. Gong Nianqiao, Zhang Weijie, Li Guoxun, Guo Hui, Ye Qifa. Institute of Organ transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
【Abstract】Objective To explore the change of MAPK cascade pathway and anti-stress response of hepatocyte after liver transplantation Methods Classified 10 normal liver specimin and 18 punctured donor liver specimin as group A(control), group B(no rejection), group C(acute rejection). MAPK, Ras, Jun and HSP70 were performed immunohistochemistry analysis, Ras and HSP70 were performed in situ hybridizition. Then image analysis was performed. Results The protein expression of MAPK、Ras、Jun increase by turns of group A,B and C,The protein expression of HSP70 is highest in group B,That of group C is lower than group B,Expression of Ras、HSP70 mRNA is as same as that of protein. Conclusion The change of MAPK cascade pathway and anti-stress response of hepatocyte after liver transplantation is one of regulation mechanism for protecting the hepatocyte from damage after liver transplantation. This mechanism is active for individual survival.
【Key words】liver transplantation;MAPK cascade pathway; anti-stress response
作者单位:430030,武汉 华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所
Email: nqgong@tjh.tjmu.edu.cn
丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)级联途径是将细胞外刺激信号传导至细胞核、介导细胞信息传递的共同通路。MAPK级联途径主要包括Ras-ERK通路、JNK-SAPK通路、p38MAPK通路和ERK5通路等。多种胞外刺激(如缺血、应激、细胞因子等)都可通过MAPK级联途径引起MAPK激活,经过MAPK核转位,激活核内转位因子,调节原癌基因及应激蛋白基因的表达,促进相关蛋白的表达,完成对胞外刺激信号的反应[1]。本文着重探讨肝脏移植后MAPK级联途径的变化及与其有关的抗应激反应。
材料与方法
1.标本获取
实验组标本18份,取自本单位自1995年至今肝脏移植患者,通过术后肝脏穿刺术获取。对照组标本10份,取自普外科相关手术中正常肝脏。肝脏穿刺术时患者取仰卧位,以第10或第11肋间腋前线处为进针点,细针穿刺获得长约2cm左右移植肝标本。免疫组织化学标本固定于体积分数10%中性福尔马林液,原位杂交固定液为体积分数4%多聚甲醛(PH7.4),含有1mg/L DEPC。切片均以多聚赖氨酸预处理,常规切片,厚约8μm。
2.实验分组
将标本按病理表现分为三组:A(对照)组、B(无排斥反应)组、C(急性排斥反应)组。A组无异常组织学表现,B组汇管区炎细胞(淋巴细胞,淋巴母细胞,中性粒细胞和嗜酸细胞)无或偶见,C组汇管区周围有炎细胞浸润,肝细胞变性(点状坏死、浊肿、脂肪变性等)或少量坏死,可伴有中/重度静脉炎。A组10例,B组10例,C组8例。每例标本均行MAPK、Ras、Jun、HSP70蛋白检测,同时行Ras、HSP70 mRNA表达水平检测。
3.免疫组织化学染色检测MAPK、Ras、Jun 、HSP70蛋白表达水平
采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法。小鼠抗人单克隆抗体MAPK McAb、Ras McAb、Jun McAb 、HSP70 McAb购自基因生物技术有限公司,链霉亲和素-生物素免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。切片常规脱蜡至水。体积分数3%H2O2室温5分钟灭活内源性酶。0.01mol/L枸椽酸盐缓冲液(PH6.0)中沸腾后间隔5分钟2次,冷却后0.1 mol/L PBS洗涤2次。抗原修复液室温20分钟,PBS洗。山羊血清封闭液室温20分钟。甩去多余液体,不洗。滴加一抗(MAPK McAb、Ras McAb、Jun McAb 、HSP70 McAb),37℃1小时,PBS洗。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃20分钟,PBS洗。滴加试剂SABC37℃20分钟,PBS洗。取DAB显色试剂盒内1m1蒸馏水,加A,B,C试剂各一滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗。苏木素轻度复杂。脱水,透明,封片。
4. 原位杂交方法检测Ras、 HSP70 mRNA表达水平
预杂交液和Ras、HSP70寡核苷酸探针杂交液购自基因生物技术有限公司。SABC和DAB试剂盒同上。所有液体试剂及容器都经DEPC处理。切片常规脱蜡至水。H2O2室温10分钟。蒸馏水洗2次。 滴加新鲜稀释的蛋白酶K 1μg/ml,37℃消化15分钟,暴露mRNA核酸片段。干的杂交盒底部加体积分数20%甘油20m1以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱370C4小时。吸取多余液体,不洗。 按每张切片20μ1加杂交液。专用盖玻片保护膜盖切片。恒温40℃过夜。揭掉盖玻片,370C2×SSC洗涤5分钟2次; 0.5×SSC15分钟1次; 0.2×SSC15分钟l次。 30g/LBSA370C保温30min。封闭液370C30分钟。甩去多余液体,不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60分钟。 0.5 mol/L PBS洗。滴加SABC37℃20分钟。PBS洗。滴加生物素化过氧化物酶37℃20分钟。PBS洗。 DAB显色。复染,脱水,透明,封片。
5.免疫组织化学染色和原位杂交染色图像分析检测
待测切片每张测4个高倍视野,在HPIAS-1000图象分析系统上作灰度分析,测定免疫组织化学染色和原位杂交染色阳性指数。阳性指数(PI)=(阳性信号面积×阳性信号平均灰度值)/测定面积
6.统计学方法
t检验。
结 果
实验各组别MAPK、Ras、Jun 、HSP70蛋白免疫组织化学染色阳性指数详见表1。A、B、C组各指标组内无统计学差异,组间均P<0.05,有统计学差异。MAPK、Ras、Jun 蛋白表达在A、 B和C组依次增高, HSP70蛋白表达在B组最高,C组较B组有下降。
Ras原位杂交染色阳性指数A、 B、C组依次为1.01±0.02、1.23±0.03、2.36±0.42,HSP70 mRNA阳性指数A、 B、C组依次为0.81±0.28、2.09±0.11、0.71±0.02。A、B、C组各指标组内无统计学差异,组间均P<0.05,有统计学差异。Ras、HSP70 mRNA表达与蛋白表达呈现同步性。
表1 MAPK、Ras、Jun 、HSP70蛋白表达水平
|
MAPK |
Ras |
Jun |
HSP70 |
A |
0.88±0.26 |
1.47±0.17 |
0.71±0.22 |
0.97±0.14 |
B |
1.15±0.07 |
3.47±0.55 |
0.93±0.37 |
3.06±0.23 |
C |
9.33±0.37 |
5.88±0.62 |
1.58±0.27 |
1.25±0.13 |
讨 论
MAPK是一族胞浆内广泛分布的含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶,分子量为40-46KD,在体外可使髓磷脂碱性蛋白的苏氨酸残基磷酸化,为ERK的基因产物。由于ERKs既可经细胞生长因子及G蛋白偶联受体途径激活,也可通过佛波酯激活蛋白激酶C而被激活,因此MAPK是胞外刺激传向胞外的信号传导通道的交汇点[2]。MAPK级联途径介导的重要生理生化反应主要有两大类:1,介导生长因子或激素引起的信号,引起细胞的增殖和分化;2,介导胞外环境应激条件信号,引起细胞抗应激反应。
MAPK激活后,或停留在胞质中,激活一系列其它的蛋白激酶,或进入细胞核,通过磷酸化转录因子调控基因的表达,包括fos, myc, jun等,表现为细胞周期的调控、增殖与分化、抗应激反应等。其中,由Jun 和Fos家族成员组成的转录因子复合物AP-1为MAPK信号通路的作用底物之一。
分子伴侣作为一组进化保守的蛋白家族,通过改变或修饰其它蛋白质,影响或调节其它蛋白功能从而发挥间接作用。在它的诸多种类中,研究较多的有热休克蛋白(heat shock protein, HSP)家族。HSP70是HSP中最保守和最主要的一类,主要功能是促进新生多肽链的正确折叠,阻止不可逆聚集,对分子重排、蛋白质解聚和新生多肽的跨膜运输起重要作用。HSP70是细胞抗应激反应的重要功能蛋白之一。缺血再灌注损伤和免疫损伤可诱导编码许多直接或间接与细胞存活有关的蛋白产物的基因,主要有两类,一类是存活基因, 如热休克蛋白、生长因子等, 一类是抗凋亡基因[3]。可逆性脑缺血的研究中发现, MAPK级联激活及其对DNA转录和mRNA翻译的影响支持了细胞的存活,缺血区HSP mRNA表达增加[4]。
HSP是MAPK级联途径的作用底物, HSP 的表达有利于组织结构和功能的修复。在肝脏移植后,移植肝脏面临着机体内多种免疫性攻击和非免疫性损伤,细胞处于应激状态,影响了细胞分子伴侣如HSP的表达。移植肝脏HSP70表达升高,提示细胞对所遭受的免疫损伤呈现修复反应。HSP70转基因小鼠的研究也表明,HSP70对器官有明显的保护作用[5]。
移植后肝细胞的MAPK、Ras、Jun蛋白表达明显升高, 当出现排斥反应时更为明显。这说明移植后机体内免疫和非免疫因素对肝细胞的刺激影响到细胞膜的信号转导。细胞膜上的G蛋白将信号传递入细胞质中并影响到MAPK级联途径。MAPK蛋白表达量增加,通过Ras-ERK通路及JNK-SAPK通路等进一步向核内传递信号,引起细胞的抗应激反应。Ras蛋白一方面是MAPK级联途径的重要参与者,同时也可能作为小G蛋白家族成员增强第一信号向胞内的传递过程。JNK-SAPK通路则可通过JNK蛋白质激酶磷酸化C-Jun而增强其活性。MAPK、Ras及Jun的蛋白量增加在MAPK级联途径的不同环节上体现了外界刺激信号向胞内传递及放大的过程。当肝细胞遭到排斥反应时,胞外各种细胞因子、供体特异性的抗体及活化的CD4、CD8 T细胞,对肝细胞膜的刺激更为强烈,表现为MAPK、Ras及Jun蛋白表达量的进一步增加。对Ras的蛋白及mRNA的测定表明,基因的转录及翻译过程呈同步的增强,说明整个级联途径在顺利有效的进行。
但对HSP70蛋白及mRNA的测定发现移植后肝细胞内表达量会迅速上升,而当出现排斥反应时反而有所下降, 尽管其时MAPK级联途径的信号却是在进一步强化的。这一结果体现出细胞信号传递过程中的放大与抑制的平衡特点。当MAPK级联途径的信号持续强化超过一定的限度时,胞内的去磷酸化过程也获得激活,并体现出抑制效应:靶基因的转录及翻译受到抑制。此时如果不能有效地控制排斥反应,肝细胞将不再能针对所受到的创伤作出有效的具有保护意义的抗应激反应,出现凋亡或坏死。HSP70蛋白及mRNA表达量在发生排斥反应时下降,从分子生物学水平说明了排斥反应早期诊断及治疗的重要性。
MAPK级联反应和抗应激反应的增强与减弱,均是细胞为维持自身正常机能的保护性反应。肝脏细胞承受着体内绝大部分的生化代谢过程,这种自我保护机制对维持个体存活有积极意义,是生物进化过程中形成的精细调节机制。从分子水平认识移植肝脏所承受的创伤和压力,有助于寻找能减轻排斥反应损伤和保护肝脏的新方法、新药物,从而进一步提高肝脏移植的整体疗效。
参考文献
1. Mizoguchi T, Ichimura K, Shinozaki K. Environmental stress response in plants: the role of mitogen-activated protein kinases. Trends Biotechnol. 1997 Jan;15(1):15-19
2. Xing J, Kornhauser JM, Xia Z, et al. Nerve growth factor activates extracellular signal-regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase pathways to stimulate CREB serine 133 phosphorylation. Mol Cell Biol. 1998 Apr;18(4):1946-55
3. Koistinaho J, Hokfelt T. Altered gene expression in brain ischemia. Neuroreport. 1997 Jan 20;8(2):i-viii.
4. Kokaia Z, Zhao Q, Kokaia M, et al. Regulation of brain-derived neurotrophic factor gene expression after transient middle cerebral artery occlusion with and without brain damage. Exp Neurol. 1995 Nov;136(1):73-88.
5. Nina B Radford, Maggy Fina, Ivor J Benjamin, et al. Cardioprotective effects of 70KD heat shock protein in transgenic mice. Proc Nat Acad Sci USA,1996; 93:2339-2342
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