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华中科技大学同济医学院附属同济医院
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器官移植
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- 反义细胞外信号调节激酶对移植物血管的保护作用
- 作者:宫念樵|发布时间:2009-04-24|浏览量:205次
反义细胞外信号调节激酶对移植物血管的保护作用
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30300324)
作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院 武汉同济医院器官移植外科宫念樵
器官移植教育部/卫生部重点实验室(通讯作者:宫念樵)
董冲 陈知水 宫念樵 陈曦林 郭晖
【摘要】 目的 探讨反义细胞外信号调节激酶(ERK1/2)基因治疗对移植物血管的保护作用及可能的保护机制。方法 建立BN至Lewis大鼠的腹主动脉移植模型。反义ERK1/2治疗组移植前取供者动脉血管段给予经脂质体包装的反义ERK1/2基因转染;腹主动脉移植术后1个月内受者每日从尾静脉或阴茎背静脉注入经脂质体包装的反义ERK1/2寡核苷酸100μl。对照组移植未经任何处理的血管段,移植后也无特殊处理。移植术后60 d取移植段主动脉进行组织病理学观察内膜和胶原纤维变化;免疫组织化学法观察移植段血管ERK1/2的表达和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润;ELISA法检测血清中细胞间粘附分子(ICAM-1)的变化。结果 移植术后60 d,对照组的移植动脉呈慢性移植物血管病表现,血管内膜显著增厚,移植血管中ERK1/2高表达,CD4+、CD8+ T淋巴细胞大量浸润;反义ERK1/2治疗组移植动脉呈血管内膜炎改变,ERK1/2表达不明显,内膜有少量CD4+、CD8+T淋巴细胞;对照组ICAM-1表达显著高于反义ERK1/2治疗组(P<0.05)。结论 反义ERK1/2基因治疗对移植物血管具有保护作用,可以减缓慢性移植物血管病的发生,这种保护机制可能和减少ICAM-1的表达、减少移植血管T淋巴细胞的浸润有关。
【关键词】慢性移植物血管病;丝裂素活化蛋白激酶;细胞外信号调节激酶
The impact of anti-sense ERK1/2 gene therapy upon chronic graft arteriosclerosis in rat aortic transplants. Dong Chong, Chen Xilin, Gong Nianqiao, Guo Hui,Chen Zhishui. Institute of organ transplantation, Tongji Hospital, Tongji medical college, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030,China
【Abstract】 Objective To investigate the protection and possible mechanisms of anti-sense ERK1/2 gene therapy upon chronic graft arteriosclerosis in rat aortic transplants.Method Male Lewis (LEW, RT1l) rats received male Brown Norway (BN; RT1.An) aorta allografts. The group of anti-ERK1/2 gene therapy was transfered anti-ERK1/2 gene. The rats were sacrificed 60 days after the operation and the grafted aortas were evaluated histologically and immunohistochemically. And used ELISA to detect the change of ICAM-1 in different groups. Result Control groups were presented chronic graft arteriosclerosis,marked neointima formation was observed, with distinct expression of ERK1/2 and T ymphocyte infiltration in neointima, media, and adventitia, marked expression of ICAM-1 in serums; In anti-ERK1/2 therapy group, neointima formation was halted,just few ERK1/2 expression and T lymphocyte were infiltrated in the neointima,and express of ICAM-1 was inhibited.Conclusion Anti-sense ERK1/2 gene therapy can prevented the development of graft arteriosclerosis in the rat aortic transplant model and the protective role may correlate with decreased expression of ICAM-1,and inhibition of the infiltration of CD4+ and CD8+T lymphocyte.
【Key words】 aorta transplantation; chronic transplant arteriosclerosis; mitogen activated protein kinase(MAPK); extracellular signal-regulated kinase(ERK); ICAM-1
随着新型免疫抑制剂在器官移植中的运用,移植后急性排斥反应发生率显著降低,同时慢性排斥反应上升成为导致移植物功能丧失的重要因素。如何控制慢性排斥反应成为目前器官移植领域亟待解决的问题。细胞外信号调节激酶 (ERK1/2)是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的主要成员之一,当其特异的苏氨酸/酪氨酸双位点磷酸化时被活化[1],可将信号传导给细胞核,从而调节细胞增殖、分化和有丝分裂。本研究采用针对ERK1/2的mRNA的反义基因治疗,研究其对慢性移植物血管病的影响。
材料与方法
1.实验动物:供者为近交系雄性BN大鼠,受者为近交系雄性Lewis大鼠,体重200~300g,购自北京维通利华生物公司。
2.试剂:全硫代修饰的寡核苷酸由上海生工公司合成,序列参照文献[2], ERK1/2反义寡核苷酸序列为: 5′-GCCGCCGCCGCCGCCAT-3′,与ERK1/2 mRNA翻译起始部位的17个碱基的序列互补;随机寡核苷酸序列为5′-CGCGCGCTCGCGCACCC -3′,所含碱基的种类和数量与反义寡核苷酸相同,但顺序随机排列;脂质体Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司;ERK1/2单克隆抗体购自Cell Signaling公司;小鼠抗大鼠CD4+ 和 CD8+单克隆抗体购自SantCruz公司;SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司;大鼠ICAM-1 ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。
3.ERK1/2基因包装:反义ERK1/2和随机ERK1/2基因与脂质体均按1:2(体积)比例混合,基因浓度为1μg/μl,振荡混匀30 min后备用。取供者动脉血管,肝素冲洗管腔,分别灌注经脂质体包装的随机ERK1/2寡核苷酸100μl和反义ERK1/2寡核苷酸100μl;置于4℃保存,1 h后用于移植。
4.实验分组:BN大鼠对Lewis大鼠的腹主动脉移植模型参照Shimizu 方法[3]进行。实验共分3 组,每组6 只大鼠接受血管移植。随机ERK1/2对照组和反义ERK1/2治疗组分别移植经脂质体包装的随机和反义ERK1/2寡核苷酸的血管段,术后1个月内随机ERK1/2对照组和反义ERK1/2治疗组供者分别每日注射经脂质体包装的随机和反义ERK1/2寡核苷酸100μl,用1ml生理盐水稀释后从尾静脉或阴茎背静脉注入;对照组移植未经任何处理的血管段,移植后也无特殊处理。
5.组织形态学检测:血管移植物于术后60 d取出。标本用40 g/LPFA固定、包埋,切片行HE染色,观察移植物病理表现;应用计算机图象分析系统采集图像,每个标本在高倍视野下随机取5处,测量增生的内膜厚度,取平均值;Masson三色染色观察胶原纤维的分布。
6.免疫组织化学法检测移植动脉ERK1/2表达和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润:按照SP免疫组织化学试剂盒说明书操作。阳性判断:ERK1/2表达阳性为胞浆呈棕黄色颗粒状;CD4+ 、CD8+T淋巴细胞细胞膜呈棕黄色颗粒状。计算每400x视野阳性细胞数。
7.ELISA法检测血清中细胞间粘附分子(ICAM-1)的变化:术后60 d取受者静脉血分离血清,测血清中ICAM-1的浓度。
8.统计学处理:实验数据采用SPSS11.5统计软件包进行分析,所有结果用均数±标准差表示。组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1.HE染色及Masson 三色染色:对照组和随机ERK1/2对照组病理改变为典型的移植物血管病的表现:内膜显著增厚,大量成纤维细胞增生,中膜含4~6层弹力纤维和平滑肌构成,内弹力纤维有断裂;Masson染色显示增生的血管内膜由大量的绿色胶原构成。反义ERK1/2治疗组病理呈移植动脉内膜炎表现:内膜增生不明显,细胞有水肿,内膜有少量淋巴细胞浸润;Masson染色内膜胶原纤维增生不明显。
2.移植动脉ERK1/2蛋白表达和CD4、CD8+T淋巴细胞浸润:对照组和随机ERK1/2对照组移植动脉有大量的CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润,ERK1/2蛋白明显表达在内膜增生的成纤维细胞和浸润的淋巴细胞中;反义ERK1/2治疗组移植动脉内膜下有少量CD4+及CD8+T淋巴细胞浸润,仅见少量表达ERK1/2蛋白的淋巴细胞和成纤维细胞。见表1。
3.血清ICAM-1浓度:对照组和随机ERK1/2组血清ICAM-1的值显著高于反义ERK1/2治疗组,其差异有统计学意义。见表1。
讨 论
临床研究表明移植物血管病术后3年发生率大约40%,5年发生率增加到50%[3] 。移植物血管病的发生机制包括免疫及非免疫因素,其中免疫反应是引起移植物血管病的核心因素,非免疫因素在免疫因素的基础上发挥作用。CD4+和CD8+T淋巴细胞在移植后急、慢性排斥反应中均起到关键作用。缺乏功能性T淋巴细胞的裸鼠接受主要组织相容性抗原不同的血管移植后,不出现慢性移植物血管病,但当接受CD4+T淋巴细胞输入后病理表现出慢性移植物血管病[4];小鼠心脏移植模型也证明CD8+T淋巴细胞的浸润是导致慢性排斥发生的重要因素[5]。通过转基因的方法将调节基因导入体内或移植物内,可以通过改变细胞因子的表达和减少淋巴细胞的浸润,从而减缓排斥反应的发生和增强移植物的自我保护功能。
MAPK家族在细胞的增殖、分化、转化、凋亡等方面起着重要作用。该家族广泛存在于各种细胞中,对细胞周期运行和基因表达具有重要调控作用,是细胞为维持自身正常机能的保护性反应。ERK1/2是MAPK家族的成员之一,其调节T淋巴细胞的活化、增殖和ICAM-1等细胞因子的表达。因此,阻断MAPK通路可以减缓排斥反应的发生[6,7]。
体外实验发现ERK1/2的活化与ICAM-1的产生密切相关:ERK1/2活化可以增加ICAM-1的水平,而当ERK1/2通路被阻断时,ICAM-1的水平降低[8]。本实验检测血清中ICAM-1水平,发现反义ERK1/2治疗组显著性低于对照组和随机ERK1/2组,可能是通过阻断ERK1/2通路,阻断了ICAM-1的mRNA的合成,降低ICAM-1的表达,进而下调受者血清ICAM-1的水平。ICAM-1在器官移植排斥反应中的作用表现在以下方面:(1)免疫识别阶段,在抗原呈递细胞和T淋巴细胞之间介导细胞-细胞的粘附,并作为复合刺激信号;(2)免疫效应阶段,参与T淋巴细胞和靶细胞之间的粘附及相互作用,导致各种细胞因子上调。ICAM-1的下调能够抑制炎症反应中淋巴细胞的趋化和减弱T淋巴细胞对抗原呈递细胞的识别。特别是有实验表明使用ICAM-1单抗治疗能够延长移植物存活,并可明显改善慢性排斥的病理表现[9]。这说明ICAM-1的下调能够减少CD4+和CD8+T淋巴细胞在移植物中的浸润。提示反义ERK1/2基因治疗对移植物血管的保护作用可能是通过降低受者体内ICAM-1的表达,从而减少CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润。
BN至Lewis大鼠的原位腹主动脉移植是一种简化的慢性移植物血管病模型,慢性移植物血管病变在移植后60 d表现即很典型。实验结果显示反义ERK1/2基因治疗后移植物中ERK1/2表达低于对照组和随机ERK1/2对照组,反义ERK1/2基因治疗组CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润明显低于对照组和随机ERK1/2对照组,并且减缓了慢性移植物血管病的发生,表明CD4+ 和CD8+T淋巴细胞的浸润与慢性排斥的发生有着密切的关系。
总之,使用反义ERK1/2寡核苷酸基因治疗可以减缓慢性移植物血管病。MAPK信号传导通路在慢性排斥中的作用将越来越为人们所认知,采取各种手段干预该通路,从而延缓慢性移植物血管病的发生是一项有前途的研究。
参 考 文 献
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3 Hillebrands JL, Rozing R. Chronic transplant dysfunction and transplant arteriosclerosis: New insights into underlying mechanisms. Expert Rev Mol Med, 2003, 15:1-8.
4 Ensminger SM, Spriewald BM, Witzke O, et al. Wood KJ Indirect allorecognition can play an important role in the development of transplant arteriosclerosis. Transplantation, 2002,73:279-286.
5 Fischbein MP, Yun J, Laks H, et al. Role of CD8+ lymphocytes in chronic rejection of transplanted hearts. J Thorac Cardiovasc Surg ,2002,123:803-809.
6 Yoshinari D,Takeyoshi I,Kobayashi M,et al..Effects of a p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor as an additive to university of wisconsin solution on reperfusion injury in liver transplantation. Transplantation, 2001 , 15:22-27.
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8 Vivianne I. Otto, Sergio M. Gloor et al. The production of macrophage in ammatory protein-2 induced by soluble intercellular adhesion molecule-1 in mouse astrocytes is mediated by src tyrosine kinases and p42/44 mitogen-activated protein kinase. Journal of Neurochemistry, 2002, 80:824-315.
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(收稿日期:2005-04-27)
表1 术后60 d时移植动脉的各项检测指标比较
组 别 |
n |
内膜厚度 (µm) |
CD4 阳性细胞数 |
CD8 阳性细胞数 |
ERK1/2 表达阳性数 |
血清ICAM-1水平 (μg/L) |
对照组 |
6 |
90.87±15.06 |
88.40±17.23 |
45.20±10.18 |
36.40±4.22 |
61.510 ± 15.299 |
随机ERK1/2对照组 |
6 |
88.34±13.50 |
89.00±16.17 |
46.20±9.96 |
35.60±8.29 |
64.088 ±13.674 |
反义ERK1/2治疗组 |
6 |
19.37±6.34※ |
49.20±21.16※ |
26.30±5.58△ |
8.40±2.07※ |
38.682 ± 14.429△ |
注:△与对照组相比,P<0.05 ;※与对照组相比,P<0.01
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