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华中科技大学同济医学院附属同济医院
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- 肝脏移植后的免疫损伤与热休克蛋白的表达
- 作者:宫念樵|发布时间:2009-04-24|浏览量:1253次
【摘要】 目的 探讨肝脏移植后的免疫损伤与几种主要分子伴侣/热休克蛋白表达状况之间的的内在规律。 方法 34份移植后肝脏穿刺标本和10份正常肝脏标本,分为A(无排斥反应)组、B(轻/中度急性排斥反应)组、C(重度急性排斥反应)组、D(慢性排斥反应/肝纤维化)组、E(对照)组。进行HSP60、HSP70、HSP90、HO-1等四种分子伴侣免疫组织化学分析和图像分析。结果 B和C组各指标间无统计学差异,A、D、E与B、C组间有统计学差异。HSP60在移植肝脏中表达降低,排斥反应发生时高;HSP70 和HSP90在移植肝脏中升高。HO-1肝脏移植后升高。结论 不同种类的热休克蛋白依据自身表达的特点对移植后的免疫损伤作出反应,体现了细胞的自我保护机制。武汉同济医院器官移植外科宫念樵
【关键词】 热休克蛋白; 分子伴侣; 肝脏移植; 免疫损伤
Immune injury and expression of molecular chaperone(heat shock protein) in liver transplantation. Gong Nianqiao, Li Guoxun, Ye Qifa, Guo Hui. Institute of Organ transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
【Abstract】Objective To explorer the relationship between immune injury and expression of molecular chaperone (heat shock protein)in liver transplantation. Methods Classified 34 punctured donor liver sample and 10 normal liver sample as A(no rejection)group, B(mild/moderate acute rejection)group, C(serious acute rejection)group, D(chronic rejection/fibrosis)group、E(control)group, HSP60、HSP70、HSP90 and HO-1 were performed immunohistochemistry analysis and image analysis. Results There is statistics difference between group A、D、E and B、C except group B and C. Expression of HSP60 is lower in donor than normal but becomes high when acute rejection occurs;Expression of HSP70 and HSP90 is higher in donor than normal; Expression of HO-1 is higher in donor than normal and is highest when no rejection occurs. Conclusion Molecular chaperones (heat shock protein)express in accordance with their own behavior and immune injury after transplantation. It is one kind of protection mechanism of cell.
【Key words】Heat shock protein;Molecular chaperone;liver transplantation;Immune injury
作者单位:430030 武汉市, 华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所
分子伴侣(Molecular Chaperone)是一类细胞行使正常功能所必须的、正常存在的基因/蛋白家族成员。其遗传结构在极度分化的不同物种中高度保守,对外在压力呈现全能细胞反应,基因表达迅速、显性并导致细胞进入保护状态,对各种有害刺激产生共同的细胞反应并具有交叉保护现象。分子伴侣的种类较多,如HSP70家族、HSP90家族、GRP家族、HO家族等。器官移植后供体面临着机体的免疫攻击并导致损伤,各种分子伴侣(主要是热休克蛋白家族)将作出相应反应,共同体现出保护效应。本文着重探讨肝脏移植后的免疫损伤与几种主要热休克蛋白表达状况之间的的内在规律。
材料与方法
1.标本获取
实验组标本34份,取自本单位自1995年至今肝脏移植患者,时间为术后1月至5年,通过肝脏穿刺术获取。对照组标本10份,取自正常肝脏。肝脏穿刺术时患者取仰卧位,以第10或第11肋间腋前线处为进针点,细针穿刺获得长约2cm左右移植肝标本。标本固定24h,逐级酒精(75%、85%、95%、100%、100%)至二甲苯透明,石蜡包埋。玻片均以多聚赖氨酸预处理,常规切片,厚约8μm。
2.实验分组
将标本按病理表现分为五组:A(无排斥反应)组、B(轻/中度急性排斥反应)组、C(重度急性排斥反应)组、D(慢性排斥反应/肝纤维化)组、E(对照)组。各组具体病理表现及标本份数见表1 。对标本进行常规病理分析及HSP60、HSP70、HSP90、HO-1免疫组织化学分析。术后免疫抑制治疗的基本方案为:CsA/FK506+Immuran/MMF+Prednison,B和C组的患者经用甲基强的松龙冲击治疗后排斥反应逆转。
表1 各组别病理表现及例数表
组别 |
病理表现 |
例数 |
A |
汇管区炎细胞(淋巴细胞,淋巴母细胞,中性粒细胞和嗜酸细胞)无/偶见 |
10 |
B |
炎细胞较少,仅浸润部分汇管区的胆管和血管,有少量变性肝细胞(点状坏死、浊肿、脂肪变性等) |
10 |
C |
大量炎细胞浸润汇管区周围,伴有中/重度静脉炎并扩展到肝实质,引起静脉周肝细胞坏死 |
8 |
D |
胆管消失/小叶中央瘀积/静脉周围硬化/肝细胞气球样变性或坏死和消失, 汇管区纤维组织增生,肝小叶被纤维组织分隔 |
6 |
E |
无异常组织学表现 |
10 |
3. 免疫组织化学染色及图像分析检测HSP60、 HSP70、 HSP90 、HO-1蛋白表达水平
采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法。小鼠抗人单克隆抗体HSP60McAb、HSP70 McAb、HSP90 McAb 、HO-1 McAb购自基因生物技术有限公司,链霉亲和素-生物素免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温灭活内源性酶。0.01M枸椽酸盐缓冲液中沸腾后间隔5分钟2次,冷却后0.1MPBS洗涤2次。抗原修复液室温20分钟,PBS洗。山羊血清封闭液室温20分钟。加一抗(HSP60McAb、HSP70McAb、HSP90McAb、HO-1McAb)37℃1小时,PBS洗。加生物素化山羊抗小鼠IgG37℃20分钟,PBS洗。加试剂SABC37℃20分钟,PBS洗。取DAB显色试剂盒内1m1蒸馏水,加A、B、C试剂各一滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗。苏木素轻度复杂。脱水,透明,封片。光学显微镜下观察。
每张切片测8个高倍视野,在HPIAS-1000图象分析系统上作灰度分析,测定免疫组织化学阳性指数。同时为保证能准确反应整个标本的情况,每张切片加测4个低倍视野免疫组织化学阳性指数。取算术平均数进行下一步统计学处理。免疫组织化学阳性指数(PI)=(阳性信号面积×阳性信号平均灰度值)/测定面积
t检验。
结 果
各实验组检测结果详见表2。B和C组组间各指标无统计学差异,A、D、E与B、C组组间有统计学差异(P<0.05)。
HSP60表达的特点:正常肝脏中最高;移植肝脏中均降低,其中排斥反应发生时相对较高,慢性排斥反应/纤维化时次之,无排斥反应时最低。HSP70表达的特点:正常肝脏中最低;移植肝脏中均升高,其中排斥反应发生时相对较低,慢性排斥反应/纤维化时相对较高,无排斥反应时次之。HSP90表达的特点:正常肝脏中最低;移植肝脏中均升高,其中排斥反应发生时相对较高,慢性排斥反应/纤维化时次之,无排斥反应时较低。HO-1表达的特点:正常肝脏中最低;移植肝脏中均升高,慢性排斥反应/纤维化时较低,无排斥反应时最高。
表2 免疫损伤与分子伴侣表达变化表
|
HSP60 |
HSP70 |
HSP90 |
HO-1 |
A |
0.26±0.03 |
3.06±0.23 |
0.11±0.01 |
22.42±4.03 |
B |
0.31±0.07 |
1.30±0.06 |
0.23±0.09 |
8.96±1.33 |
C |
0.42±0.02 |
1.21±0.11 |
0.27±0.05 |
8.61±0.48 |
D |
0.21±0.09 |
4.97±0.66 |
0.13±0.01 |
1.65±0.07 |
E |
1.75±0.20 |
0.97±0.14 |
0.03±0.01 |
0.96±0.05 |
讨 论
分子伴侣广泛存在于从细菌到人类所有的原核和真核细胞中,它本身不直接发挥生物作用,而是通过改变或修饰其它蛋白质,影响或调节其它蛋白功能发挥间接作用[1]。其生物学作用包括:参与功能蛋白的折叠、转运、成熟、降解,受损分子的修复,细胞内信号的传导及至细胞的增殖,分化和发育。分子伴侣在维持细胞功能、保护细胞抵抗损伤方面有着重要的作用。在肝脏移植后,供体面临着机体内多种免疫性攻击和非免疫性损伤,肝脏细胞分子伴侣的表达出现变化, 共同体现出保护效应。慢性排斥反应/纤维化、排斥反应、无排斥反应的损伤程度依次减轻,分子伴侣的表达与这一特点关系密切。
热休克蛋白(Heat shock/stress protein,HSP)占细胞总蛋白含量的5%-10%,当细胞处于应激状态时,HSP水平明显增高。HSP主要分为四个家族:HSP60家族、HSP70家族(66-78KD)、HSP90家族(83-90KD)及小HSP家族,以外还有分子量在100-110KD的大分子HSP。
HSP60家族维持肽链的伸展状态,协助跨膜转运,加速正确肽链折叠和装配。HSP60具有免疫原性,在病原体和宿主之间高度保守,与T细胞免疫应答存在交叉反应性[2]。例如,免疫结核杆菌的小鼠中,几乎1/5的T细胞为HSP60反应性CD4+T细胞。排斥反应与HSP60的表达之间应有相互促进的关系, 但移植后肝脏HSP60表达降低,这可能与免疫抑制剂的应用有关。但仍然可以观察到,排斥反应发生时HSP60表达相对较高,这是HSP60免疫原性的表现。阐明HSP60在诱导免疫反应中的作用,有助于开发以HSP60为基础的免疫治疗剂。
HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一类,主要功能是促进新生多肽链的正确折叠,对分子重排、蛋白质解聚和新生多肽的跨膜运输起重要作用,可通过改变或修饰新合成的多肽防止不正确折叠。HSP70转基因小鼠的研究发现HSP70对心肌有明显的保护作用[3]。Ingolf 等的研究表明,心脏移植患者供心排斥时较未排斥时HSP27明显升高,而HSP72升幅不明显[4]。这些研究均表明了HSP70家族对移植脏器的保护作用。移植肝脏HSP70表达升高,提示细胞对所遭受的免疫损伤呈现修复反应。排斥反应的发生可能与HSP70表达较低,对供体细胞表面受损的蛋白质修复不够,加剧了免疫反应的发生有一定关系。无排斥反应时表达较高也反证HSP70对供体的保护作用。慢性排斥反应/纤维化时细胞修复异常蛋白质的压力更大,因此HSP70表达最高。
HSP90家族是一种甾体激素受体结合蛋白,参与甾体激素与受体的相互作用,避免受体在结合相应激素前与DNA结合和作用。它参与蛋白转位和受体调节,以ATP依赖方式抑制解折迭蛋白聚集作用,是影响基质蛋白质成熟的关键因素[5]。移植肝脏内表达的HSP90一方面调节细胞内的蛋白转位,另一方面作为甾体激素受体结合蛋白,可能有助于提高内自身调节作用,同时也有益于外源性激素的治疗作用。实验组中的排斥反应患者经用甲基强的松龙冲击治疗后排斥反应均逆转。
血红素氧合酶(Hemo oxygenase, HO)家族是血红素降解的起始酶和限速酶,生理作用是催化血红素降解为胆绿素及胆红素,其代谢产物CO也是一种重要的信号分子。HO在体内有三种存在形式。其中HO-1为诱导型,其活性可提高100倍,在肝脏中呈差异性表达,存在于枯否氏细胞。HO-2的表达则持续无变化。低氧可直接或通过炎性细胞因子间接刺激HO-1的蛋白表达和基因转录。缺血缺氧导致HO-1表达及活性增加[6],内源性CO产生增加并促进NO/CO体系生成。于是血管平滑肌cGMP水平升高,血管扩张。内源性CO释放于窦周,引起肝窦生理性松弛,降低门静脉和窦状隙的阻力,增加窦状隙的血供和氧供[7]。HO-1是一个敏感的指标,缺血缺氧损伤后可很快达到较高的表达水平,从而尽快增加窦状隙的血流,使细胞可以早期修复。如果缺血缺氧损伤持续加重,其表达将出现下降趋势。免疫损伤使移植后肝脏氧供较正常肝脏为少, HO-1表达增加。而当发生慢性排斥反应/纤维化时, 长期缺血缺氧和肝小叶组织结构的紊乱所带来的压力超出细胞的代偿能力, HO-1的表达出现下降,细胞调节微环境的能力下降,往往提示预后不良。
肝脏移植后的免疫反应和免疫抑制治疗使内环境变化复杂,不同种类的分子伴侣(主要是热休克蛋白家族)将会依据自身表达的特点作出相应反应, 从不同的角度共同对损伤进行修复。移植后2周内缺血再灌注损伤虽然也会影响分子伴侣的表达,但手术1月后的免疫损伤则是影响分子伴侣持续表达的主要因素。分子伴侣的相应反应是细胞在进化过程中自我保护机制的体现,但它也可能与排斥反应间存在更复杂的因果关系,这有待进一步深入的工作。对分子伴侣表达规律的认识,有助于进一步利用分子伴侣来调控免疫反应,更好地保护移植后脏器的功能。
参考文献
1. Saito K, Katsuragi H, Mikami M, et al. Increase of heat-shock protein and induction of gamma/delta T cells in peritoneal exudate of mice after injection of live Fusobacterium nucleatum. Immunology, 1997, 90:229-235.
2. Ramage JM, Young JL, Goodall JC, et al. T cell responses to heat-shock protein 60: differential responses by CD4+ T cell subsets according to their expression of CD45 isotypes. J Immunol, 1999, 162:704-710.
3. Nina B Radford, Maggy Fina, Ivor J Benjamin, et al. Cardioprotective effects of 70KD heat shock protein in transgenic mice. Proc Nat Acad Sci USA, 1996, 93:2339-2342.
4. Ingolf Schimke, Gudrun Lutsch, Ulrike Schernes et al. Increased level of HSP27 but not HSP72 in human heart allograft in relation to acute rejection. Transplantation, 2000, 70:1694-1697.
5. Freitag DG, Ouimet PM, Girvitz TL, et al. Heat shock protein 80 of Neurospora crassa, a cytosolic molecular chaperone of the eukaryotic stress 90 family, interacts directly with heat shock protein 70. Biochemistry, 1997, 36:10221-10229.
6. Morita T, Perrelia MA, Kourembanas S. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Pron Natl Acad Sci USA, 1995, 92:1475-1479.
7. Bauer I, Wanner GA, Rensing H, et al. Expression pattern of heme oxygenase isoenzymes 1 and 2 in normal and stress-exposed rat liver. Hepatology, 1998, 27:829-838.
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