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- 谷氨酰胺对肝脏移植后应激蛋白表达的影响
- 作者:宫念樵|发布时间:2009-04-24|浏览量:382次
宫念樵# 刘敦贵 李国逊 郭 晖 张伟杰 叶启发
(华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所,武汉 430030)武汉同济医院器官移植外科宫念樵
摘要 目的 探讨谷氨酰胺对肝脏移植后应激蛋白表达的影响。方法 A组10例为正常肝脏;B组10例肝脏移植后不用丙氨酰谷氨酰胺二肽(Ala-Gln);C组8例肝脏移植后用Ala-Gln。观察标本的病理学改变和患者的营养状况,用免疫组织化学及原位杂交方法检测HSP70、HO-1蛋白和mRNA表达水平。结果 B组和C组均未见免疫排斥反应,营养状况尚可;HSP70、HO-1蛋白及mRNA表达水平移植肝脏均升高,且应用Ala-Gln后更高。结论 谷氨酰胺能增加供肝细胞应激蛋白基因转录和表达,加强肝细胞自我保护作用。
关键词 谷氨酰胺 应激蛋白 肝脏移植
中图分类号 Q517 R657。3 文献标识码 A 文章编号 1008-5882(2003)01
Impact of Glutamine in Stress Protein Expression after Liver Transplantation. Gong Nian-qiao# Liu Dun-gui Li Guo-xun Guo Hui Zhang Wei-jie Ye Qi-fa.
(Institute of Organ transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)
Abstract Objective To explorer the impact of glutamine in stress protein expression after liver transplantation。 Methods Classified 10 normal liver sample and 18 punctured donor liver sample as A(control)group, B(no Ala-Gln)group, C(Ala-Gln)group according administration of Ala-Gln. Pathology and nutritional status of all of patient were observed as well as expression of protein and mRNA of HSP70 and HO-1 were performed immunohistochemistry analysis and in situ hybridizition Results No rejection was found in B and C group. The nutritional status was good in all transplanted patients. The expression of protein and mRNA of HSP70 and HO-1 was increased after transplantation and was higher when administated Ala-Gln. Conclusion Glutamin can increase the gene transcription and protein expression of stress protein in hepatocyte after liver transplantation. That can augment self-protection of hepatocyte.
Key words glutamin ; stress protein; liver transplantation
谷氨酰胺(glutamine, Gln)作为一种重要的条件必需氨基酸(conditionally essential amino acid),近来在临床上获得广泛应用。它在改善氮平衡、提高蛋白浓度、降低肠道粘膜通透性、防止细菌移位等方面具有确切的作用,得到广泛深入的研究。本实验探讨肝脏移植后Gln增加应激蛋白基因转录和翻译的效应,从分子水平增加对Gln的认识。
# 通信作者 职务:外科医师, 职称:主治医师,电话:027-83663409,传真:027-83611175,
E-mail:nqgong@tjh.tjmu.edu.cn
材料和方法
实验分组 实验标本分3组:A(对照)组、B(无Ala-Gln)组和C(Ala-Gln)组。A组10例,取自本院普外科肝叶切除术中的正常肝脏组织;B组10例,取自本所自1995年至今肝脏移植患者,术后第2-10天使用主要营养素支持方案(表1),第10-20天恢复进食后间断使用白蛋白和复合氨基酸;C组8例,取自本所2000年至今肝脏移植患者,术后在B组营养支持方案基础上加用丙氨酰谷氨酰胺二肽(Ala-Gln)。B组和C组术后免疫抑制治疗的基本方案均为:CsA/FK506+Immuran/MMF+Prednison。
表1 肝脏移植后主要营养素支持方案
Table 1 Essential Nutrition Supporting Protocol after Liver Transplantation
Nutrition |
Volume |
Usage |
Ala-Gln |
100 ml |
2-10d,Qd;10-20d,Qod. Only in group C |
Glucose(10% or 5%) |
500 ml or 1000 ml |
With Insulin 1:4 |
Fresh frozen plasma |
200-600 ml |
Qd |
20% Alnumin |
100-200 ml |
Qd |
7% Compound amino acid |
500 ml |
Qd |
Branched chain amino acid |
500 ml |
Qd |
20% Lipovenoes MCT |
None |
None |
Electrolure,Vitamin,Microelement |
Routine |
Routine |
Total intaken volume |
3000-4000ml |
From 2d to 10d |
病理观察 B组和C组患者于术后20余天通过肝脏穿刺术获取约2cm左右标本。玻片均以多聚赖氨酸预处理,常规切片,厚8μm。常规病理分析,重点观察有无急性排斥反应。
营养状况观察 观察患者食欲、肠道功能、血红蛋白、白蛋白、肌酐及总胆固醇水平。
HSP70、HO-1蛋白表达水平检测 采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法。小鼠抗人单克隆抗体HSP70 McAb 、HO-1 McAb购自基因生物技术有限公司,链霉亲和素-生物素免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。切片脱蜡至水,灭活内源性酶,抗原修复,山羊血清封闭,一抗(HSP70 McAb 、HO-1 McAb)孵育,生物素化山羊抗小鼠IgG孵育,DAB显色,苏木素复杂。
HSP70、HO-1 mRNA表达水平检测 采用原位杂交方法。预杂交液、HSP70和HO-1寡核苷酸探针杂交液购自基因生物技术有限公司。SABC和DAB试剂盒同上。所有液体试剂及容器都经DEPC处理。切片脱蜡至水,蛋白酶K消化暴露mRNA核酸片段,预杂交,杂交,显色。复染。
免疫组织化学染色和原位杂交染色图像分析 待测切片每张测4个高倍视野,在HPIAS-1000图象分析系统上作灰度分析,测定免疫组织化学染色和原位杂交染色阳性指数。阳性指数(PI)=(阳性信号面积×阳性信号平均灰度值)/测定面积。
统计学分析 采用t检验,数据以X±S表示,P <0.05表示差异有显著性意义。
结 果
一般状况及营养状况 B组和C组患者均未出现严重感染和肺部并发症,肝功能恢复较好。B组和C组患者均食欲良好,肠道功能尚可。两组患者血红蛋白、白蛋白、肌酐和总胆固醇水平分别平均为:B组 109.1±6.9g/L、33.3±4.2g/L、58.1±9.4µmol/L和4.3±1.1mmol/L,C组 101.8.9.5±g/L、34.5±4.9g/L、60.1±8.3µmol/L和3.9±1.2mmol/L。两组间无显著差异(P>0.05)
病理表现 A组无异常,B组和C组汇管区三体(肝动脉、门静脉和胆管)无或偶见炎细胞(淋巴细胞、淋巴母细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞), 未见免疫排斥反应。
HSP70、HO-1蛋白及mRNA表达水平 HSP70蛋白及mRNA表达水平在正常肝脏最低,移植肝脏均升高,应用Ala-Gln后更高,3组间差异均有显著意义(P<0.05),见表2。HO-1蛋白及mRNA表达水平A、B和C组依次升高,A组与B、C组间有显著差异(P<0.05),mRNA表达水平A组最低,C组较B组为高,但无显著差异(P>0.05),见表2。
表2 HSP70、HO-1蛋白及mRNA表达水平
Table 2 Protein and mRNA Expression of HSP70 and HO-1
Group |
n |
HSP70 protein/ mRNA |
HO-1 protein/ mRNA |
A |
10 |
0.97±0.14/0.81±0.28 |
0.96±0.05/2.55±0.37 |
B |
10 |
2.86±0.27*/1.99±0.21* |
19.42±5.13*/9.01±0.75? |
C |
8 |
3.28±0.41*/2.33±0.23* |
23.57±3.09*/9.35±0.56? |
* P<0.05,Group B vs Group C ?P>0.05,Group B vs group C
讨 论
肝移植受体术前常因各种终末期肝病而发生代谢紊乱,术后则由于应激反应致胰高糖素及儿茶酚胺类激素等分泌增加,人体静息能量消耗增加,骨骼肌中Gln迅速消耗;糖异生加强,蛋白质和脂肪动员加强,负氮平衡加剧;胰岛素阻抗现象使葡萄糖的利用发生障碍。此时只能以少量葡萄糖作为能量底物,并输入适量氨基酸及白蛋白,而不宜过高地供给非蛋白热卡。本实验B 组和C组患者根据上述原则进行肠外营养支持,术后未发生严重并发症,血红蛋白、白蛋白、肌酐和总胆固醇水平尚可。
两组患者营养状况未见显著差异,并不能否定Ala-Gln的作用。Gln溶解度差,很难达到有效血药浓度;而Ala-Gln主要通过细胞膜上的酶在胞外水解成自由氨基酸后吸收至胞内,在血浆中降解少,故作为谷氨酰胺在临床应用。在强应激状态下,Gln虽也能在体内合成,但其需要量大大增加,合成速率降低,容易缺乏并影响机体正常功能。Gln是核酸合成的必需前体物和蛋白质合成与分解的调节物,是氨基酸从外周转运至内脏的携带者。据报道Gln能维持肠粘膜形态[1,2],增加肝脏和肌肉中的蛋白质、DNA和RNA的合成 [3-5]。
肝脏移植后补充Gln是必要的。Gln能促进应激蛋白表达,使细胞对抗外来损伤的能力显著增强, 这种作用与Gln的浓度成正相关[6]。应激蛋白是一类正常存在的高度保守的蛋白质,对外在压力呈现全能细胞反应,其基因表达迅速、显性并可致细胞进入保护状态。已发现Gln可诱导产生热休克蛋白(heat shock protein, HSP)70及其mRNA,使细胞抗损伤能力显著增强[6]。移植肝脏面临着机体内多种免疫性攻击和非免疫性损伤,处于应激状态。而在此应激状态下补充Gln则有助于肝细胞应激蛋白,如HSP70和血红素氧合酶( Hemo oxygenase, HO)1的表达。本研究发现,HSP70、HO-1蛋白及mRNA表达在移植肝脏均升高,应用Ala-Gln后更高,说明Gln可诱使供肝细胞应激蛋白基因转录和表达增强。而供肝细胞mRNA及蛋白质表达增加,致使肝细胞自我保护作用进一步加强,对供体的存活有益。
HSP70能识别暴露于部分错误折叠的蛋白表面的硫水区,阻止不可逆聚集,转运蛋白质到线粒体膜并参与蛋白质解折迭和插入膜内。转基因小鼠研究表明,HSP70对器官有明显的保护作用[7]。肝脏细胞HSP70表达升高,提示细胞对所遭受的免疫损伤呈现修复反应。Gln能提高HSP的表达,不引起毒性,同时可显著减少炎性细胞因子的释放。因此肝细胞损伤后,为了提高细胞应激应答基因的表达,应该补充Gln。
HSP 的另一作用为对抗中性粒细胞介导的内皮细胞坏死,保护内源性L-精氨酸NO 途径,维持内皮源性NO释放,减少灭活[8]。内皮源性NO使来自血红素蛋白的游离血红素释放增加,诱导HO表达,其机制与内源性NO诱导HO-1的基因表达和转录水平增加有关[9]。HO-1代谢产物CO是一种重要的信息分子,通过cGMP调节血管紧张度,产生内源性CO抑制平滑肌细胞收缩,引起血管扩张。内源性CO释放于窦周,引起肝窦生理性松弛,降低门静脉和窦状隙的阻力,增加窦状隙的血流。病理状态下,内皮源性NO产生减少,而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性增加,由iNOS产生过多的NO刺激细胞凋亡和胶原组织降解,还可与过氧阴离子反应形成过氧化亚硝酸盐,引起组织损伤[10],而这种损伤可被HSP保护。HO-CO系统也可抑制iNOS的活性而发挥对机体的保护作用。分析HO-1蛋白及mRNA表达增加的原因,一方面与应激及Ala-Gln的应用有关,另一方面与HSP的作用有关,两者的作用密不可分。
术后应用Gln可提高机体杀菌能力和肠道功能,同时能增强免疫功能[11]。Gln通过影响淋巴细胞代谢、多种激素以及细胞因子的分泌等对免疫应答发挥作用[12],是淋巴细胞和巨噬细胞的主要能源,又是淋巴细胞受抗原刺激后大量增殖分化中核苷酸合成的重要前体[13-14]。但肝脏本身为免疫特惠器官,术后又使用CsA/FK506等强效免疫抑制剂,Gln增强免疫的作用显得很弱,故可略为不计。本组Ala-Gln组未见排斥反应。
Gln增强HSP和HO-1及其mRNA表达,从作用机制上进一步解释了Gln是如何发挥临床作用的。
参考文献
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