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华中科技大学同济医学院附属同济医院
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- 多种信号传导通路在肝脏移植中的作用
- 作者:宫念樵|发布时间:2009-04-24|浏览量:2091次
宫念樵 李国逊 肖建生 郭晖 叶启发
华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所,武汉 430030武汉同济医院器官移植外科宫念樵
【摘要】 目的 探讨肝脏移植后多种信号传导通路及相关信号分子的变化规律。 方法 将标本按病理表现分为五组:A(无排斥反应)组10例、B(轻/中度急性排斥反应)组10例、C(重度急性排斥反应)组8例、D(慢性排斥反应/肝纤维化)组6例、E(正常对照)组10例。每例标本行MAPK、Ras、p53蛋白检测和MAPK、Ras mRNA表达水平检测。结果 MAPK、Ras蛋白表达在A、 B和C组依次增高,在D和E组降低;p53蛋白表达在移植后各组均升高,MAPK、Ras mRNA表达与蛋白表达呈现同步性。结论 MAPK途径促进细胞自我修复,或进入增殖和分化状态以进行代偿, p53阻滞受损的肝细胞于G1期并获得修复的机会或凋亡,减少细胞异常分化。MAPK途径和 p53途径分别在肝移植后细胞周期调控中的不同方面承担保护肝细胞的作用。
【关键词】 肝脏移植;MAPK级联途径; p53
肝移植后机体发生了一系列复杂的生理和病理变化,然而目前我们对其中的许多机理仍还不清楚,尤其是信号传导通路在其中所起的作用。实际上,信号传导通路是机体应对外界刺激,精细调节机体反应的重要机制,在肝移植中,同样有多种信号传导通路参与了这一过程。本文着重探讨肝脏移植后丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)信号传导通路及细胞周期重要调控分子p53等这两种信号传导通路的变化规律及其与肝移植后排斥反应的关系。
材料与方法
1.标本获取
实验组标本34份,取自本单位自1995年至今肝脏移植患者,通过术后肝脏穿刺术获取。对照组标本10份,取出普外科相关手术中正常肝脏。肝脏穿刺术时患者取仰卧位,以第10或第11肋间腋前线处为进针点,细针穿刺获得长约2cm左右移植肝标本。免疫组织化学标本固定于10%中性福尔马林液,原位杂交固定液为4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.4),含有1/1000DEPC。切片均以多聚赖氨酸预处理,常规切片,厚约8μm。
2.实验分组
将标本按病理表现分为五组:A(无排斥反应)组、B(轻/中度急性排斥反应)组、C(重度急性排斥反应)组、D(慢性排斥反应/肝纤维化)组、E(对照)组。各组具体病理表现及标本份数见表1 。术后免疫抑制治疗的基本方案为:CsA/FK506+Immuran/MMF+Prednison,B和C组的患者经用甲基强的松龙冲击治疗后排斥反应逆转。每例标本均行MAPK、Ras、p53蛋白检测,同时行MAPK、Ras mRNA表达水平检测。
表1 各组别病理表现及例数表
组别 |
病理表现 |
份数 |
A |
汇管区炎细胞(淋巴细胞,淋巴母细胞,中性粒细胞和嗜酸细胞)无/偶见 |
10 |
B |
炎细胞较少,浸润部分汇管区的胆管和血管,有少量变性肝细胞(点状坏死、浊肿、脂肪变性等) |
10 |
C |
大量炎细胞浸润汇管区周围,伴有中/重度静脉炎并扩展到肝实质,引起静脉周肝细胞坏死 |
8 |
D |
胆管消失/小叶中央瘀积/静脉周围硬化/肝细胞气球样变性或坏死和消失, 汇管区纤维组织增生,肝小叶被纤维组织分隔 |
6 |
E |
无异常组织学表现 |
10 |
3.免疫组织化学染色检测MAPK、Ras、p53蛋白表达水平
采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法。小鼠抗人单克隆抗体MAPK McAb、Ras McAb、Jun McAb 、HSP70 McAb购自基因生物技术有限公司,链霉亲和素-生物素免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温5分钟灭活内源性酶。0.01M枸椽酸盐缓冲液(PH6.0)中沸腾后间隔5分钟2次,冷却后0.1MPBS洗涤2次。抗原修复液室温20分钟,PBS洗。山羊血清封闭液室温20分钟。甩去多余液体,不洗。滴加一抗(MAPK McAb、Ras McAb、Jun McAb 、HSP70 McAb),37℃1小时,PBS洗。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃20分钟,PBS洗。滴加试剂SABC37℃20分钟,PBS洗。取DAB显色试剂盒内1m1蒸馏水,加A,B,C试剂各一滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗。苏木素轻度复杂。脱水,透明,封片。
4. 原位杂交方法检测MAPK、ras mRNA表达水平
预杂交液和Ras、HSP70寡核苷酸探针杂交液购自基因生物技术有限公司。SABC和DAB试剂盒同上。所有液体试剂及容器都经DEPC处理。切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温10分钟。蒸馏水洗2次。 滴加新鲜稀释的蛋白酶K 1μg/ml,37℃消化15分钟,暴露mRNA核酸片段。干的杂交盒底部加20%甘油20m1以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱370C4小时。吸取多余液体,不洗。 按每张切片20μ1加杂交液。专用盖玻片保护膜盖切片。恒温40℃过夜。揭掉盖玻片,370C2×SSC洗涤5分钟2次; 0.5×SSC15分钟1次; 0.2×SSC15分钟l次。 3%BSA370C保温30min。封闭液370C30分钟。甩去多余液体,不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60分钟。 0. 5M PBS洗。滴加SABC37℃20分钟。PBS洗。滴加生物素化过氧化物酶37℃20分钟。PBS洗。 DAB显色。复染,脱水,透明,封片。
5.免疫组织化学染色和原位杂交染色图像分析检测
待测切片每张测4个高倍视野,在HPIAS-1000图象分析系统上作灰度分析,测定免疫组织化学染色和原位杂交染色阳性指数。阳性指数(PI)=(阳性信号面积×阳性信号平均灰度值)/测定面积
6.统计学方法
t检验。
结 果
实验各组别免疫组织化学和原位杂交染色阳性指数详见表1、2。MAPK和Ras在各指标组内无统计学差异,B、C组与A、D、E组组间均P<0.05,有统计学差异;p53蛋白表达中A、B、C、D组与E组有统计学差异(P<0.05)。MAPK、Ras蛋白表达在A、B和C组依次增高,D组E组依次下降;HSP70蛋白表达在各实验组均高于正常对照组;MAPK、ras mRNA表达与蛋白表达呈现同步性。
表1 MAPK、Ras、p53蛋白表达水平
|
A |
B |
C |
D |
E |
MAPK |
1.42±0.15 |
3.88±0.37 |
6.68±0.54 |
1.49±0.15 |
0.88±0.26 |
Ras |
1.27±0.34 |
2.80±0.31 |
3.93±0.43 |
1.47±0.17 |
1.01±0.13 |
p53 |
2.09±0.22 |
2.39±0.24 |
2.03±0.72 |
2.26±0.24 |
0.35±0.05 |
表2 MAPK、ras mRNA表达水平
|
A |
B |
C |
D |
E |
MAPK |
0.88±0.26 |
1.85±0.19 |
4.81±0.50 |
1.26±0.17 |
0.79±0.07 |
ras |
1.07±0.11 |
2.29±0.42 |
3.99±0.45 |
1.21±0.26 |
0.92±0.13 |
讨 论
肝移植是目前公认的许多终末期肝脏疾病的唯一有效的治疗方法,然而对肝移植后一系列复杂的病理生理变化所知的仍有限。作为机体应对内外环境变化的信号传导通路无疑参与了这一过程。MAPK、Ras及p53都是机体重要的调控信息分子,MAPK和Ras是MAPKs通路中的重要信号分子,p53是细胞周期中的重要调控分子,它们在肝移植后病理过程中的不同方面起了不同的作用。
MAPKs通路是一个重要的核内激活转录因子反应通路,是将细胞外刺激信号传导至细胞核、介导细胞信息传递的共同通路,许多细胞外的刺激因子(如缺血、应激、细胞因子等)都通过此通路进行精细的细胞内调控。MAPK家族在哺乳动物细胞中主要有三种信号传导途径,分别是细胞外信号相关蛋白激酶(extracellular signal-related protein kinase, ERK)、p38-MAPK和c-jun amino-terminal protein kinase(JNK)[1]。Ras是MAPKs通路上重要的信号分子。以ERK为例,生长因子首先活化受体Tyr激酶,由此引起Ras激活和膜上raf激酶活化,接着是MAPK激酶(MAPKK)和ERK1/ERK2的顺序活化,ERK易位进入核内,在核内激活转录因子TCF,活化的TCF与靶基因启动子顺式调控元件结合,调节靶基因的转录[2]。
MAPK级联途径介导的主要生理过程有两大类:1,介导生长因子或激素引起的信号,引起细胞的增殖和分化;2,介导胞外环境应激条件信号,引起细胞抗应激反应。但MAPK级联途径在移植后的的作用目前仍不完全清楚,这与MAPK级联途径的调控多样性是分不开的。有研究表明MAPK级联途径对细胞增殖与调亡的调节具有双向性,ERK(Ras是其重要组成部分)被激活后主要导致细胞的增殖与增生,而p38-MAPK和JNK被激活后主要导致细胞调亡 [3,4]。
本研究结果表明,MAPK级联途径与临床肝移植排斥反应有关:随着免疫排斥反应强度的增加,MAPK和Ras的表达也随之增加,呈现出正相关的关系。在较强的急性排斥反应中MAPK和Ras的表达最高,在较弱的急性排斥反应中MAPK和Ras的表达也随之下降。文献表明MAPK级联途径与心脏及小肠的排斥反应也有关[5] 。这提示,当肝细胞遭到排斥反应时,肝细胞膜所受的刺激强烈,致使MAPK、Ras蛋白表达增加。另一方面,肝细胞受损也可能加剧排斥反应的程度。由此临床上表现出MAPK级联途径与排斥反应的正向关联。同时由于肝细胞受损,MAPK级联途径可能也会引起细胞的增殖和分化。在慢性排斥反应发生时,MAPK和Ras的表达进一步下降,则可能与慢排时以间质增生反应为主有关。在整个过程中,MAPK和ras的mRNA水平与其蛋白表达水平一致,说明转录的mRNA都进行了有效的蛋白合成。
作为一个重要的细胞周期调控因子, p53先前在肝移植中的研究多集中在肿瘤转移和复发的关系上[6] 。p53可与细胞内转录因子(如p21等)结合并起到活化作用,p21作为p53的下游基因和转录激活产物,具有抑制细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶(CDK)的底物磷酸化作用,导致G1期阻滞,使细胞在进入S期之前可修复损伤的DNA。若DNA损伤过重,则细胞进入凋亡程序[7]。有研究表明DNA的损伤与p53表达是同时的,如果DNA受损,p53蛋白水平就增高,终止细胞增殖,使受损细胞获得修复DNA的时间,如果细胞DNA受损无法修复,则p53蛋白水平持续增高,引起细胞凋亡[7]。在本研究中,p53蛋白水平在急排和慢排中均明显高于正常对照组,然而并未表现出随排斥反应的强弱而出现表达量的明显增减,而且在慢排中亦有较高表达。推测p53可能在强烈的排斥反应中起到对细胞DNA的保护和修复作用,同时可能促使DNA重度受损的细胞凋亡,并且对慢排中出现的大量间质细胞增生起监控和保护作用。由于目前有关此方面的研究还不多见,故此结论尚有待进一步的验证。
MAPK途径和 p53途径在肝移植后细胞周期调控中的不同方面起了不同的作用,MAPK途径促进受损的肝细胞进行自我修复,必要时使细胞进入增殖和分化状态以进行代偿,肝细胞所受损伤愈强烈,MAPK的活化程度就愈高,这是肝细胞自我保护机制的体现。p53则阻滞受损的肝细胞于G1期,使受损的DNA获得修复的机会,若DNA损伤过重,肝细胞则进入凋亡程序,从而减少肝细胞基因变异和异常分化的发生,避免诱发恶性疾病。因此,MAPK途径和 p53途径分别在肝移植后细胞周期调控中的不同方面承担保护肝细胞的作用。
细胞信号传导通路和信号分子在器官移植的许多方面都起到了重要的作用,机体对细胞进行精细的调控均有赖于此。此研究初步探讨了MAPK和p53通路在临床肝移植后的变化规律,有助于深刻理解器官移植的病理过程和排斥反应的分子机制,从而提出相应的应对策略。
参考文献
1. I. Iesalnieks, M. Rentsch, E. Lengyel, et al. JNK and p38MAPK Are Activated During Graft Reperfusion and Not During Cold Storage in Rat Liver Transplantation. Transplantation Proceedings, 2001, 33: 931?32
2. 刘景生,细胞信息与调控。第一版,北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998,271-81
3. Yoshinari Daisuke, Takeyoshi Izumi, Kobayashi Mitsunobu, et al. Effects of a p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Inhibitor as an Additive to University of Wisconsin Solution on Reperfusion Injury in Liver Transplantation. Transplantation, 2001, 72(1):22-7
4. Xia Zhengui, Dickens Martin, Raingeaud Joel, et al. Opposing Effects of ERK and JNK-p38 MAP Kinases on Apoptosis. Science, 1995, 270(5240): 1326-31
5. Y. Tatekawa, H. Kanehiro, H. Kanokogi, et al. Intragraft Expression of p38 in Rat Small Bowel Transplantation. Transplantation Proceedings, 2000, 32: 1281?2
6. Rosenau Jens, Bahr Matthias J., von Wasielewski Reinhard, et al. Ki67, E-Cadherin, and p53 as Prognostic Indicators of Long-Term Outcome after Liver Transplantation for Metastatic Neuroendocrine Tumors. Transplantation, 2002, 73(3): 386-94
7. Sheikh MS,Chen YQ, Smith ML, et al. Role of p21WAF1/CIP1/Sdil in cell death and DNA repair as studied using a tetracycline-inducible system in p53-deficient cells. Oncogene, 1997;14:1875
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