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- 宫念樵主任医师
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医院:
华中科技大学同济医学院附属同济医院
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器官移植
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- 小剂量骨髓细胞联合脾细胞输注调节受体特异性免疫状态的研究
- 作者:宫念樵|发布时间:2009-04-24|浏览量:405次
王大卫1王海灏 1朱兰1程敦秀1刘云2宫念樵1 张伟杰1 陈知水1叶启发2
(1.华中科技大学同济医院器官移植研究所,武汉430030;武汉同济医院器官移植外科宫念樵
2.中南大学湘雅三医院器官移植研究院,长沙 410008)
摘要: 目的 建立供体小剂量骨髓细胞输注同时联合脾细胞输注对受体特异性免疫状态的调节方法,建立相应的评估体系,探索其调节效应。方法C57BL/6小鼠输注小剂量BALB/C小鼠骨髓细胞或骨髓细胞脾细胞联合输注,观察受体存活状况,3月后建立混合淋巴细胞培养体系,评估受体特异性免疫状态。结果 受体存活好,移植物抗宿主反应强度较低,混合淋巴细胞反应联合输注较骨髓细胞输注稍低但无显著性差异。结论 供体骨髓细胞联合脾细胞输注可以在减少骨髓细胞输注量时仍有效调节受体特异性免疫状态,混合淋巴细胞培养体系是一种有价值的评估方法。
关键词: 骨髓细胞输注 脾细胞 混合淋巴细胞培养
The donor splenocyte infusion combining low-dose bone marrow infusion modulates the specific immune response in recipients
WANG Da-wei1, WANG Hai-hao1, ZHU Lan1, CHENG Dun-xiu1,LIU Yun2,GONG Nian-qiao1, ZHANG Wei-jie1,CHEN Zhi-shu1i, YE Qi-fa2
(1.Institute of Organ Transplanttaion,Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030,P.R.China;
2.College of Organ Transplanttaion,The third Hospital of Xiangya,Zhongnan University, Changsha 410008 P.R.China)
Abstract:【Objectives】To establish the donor splenocyte infusion combining bone marrow infusion to modulate the specific immune response in recipients and the system to evaluate. 【Methods】 C57BL/6 mice received the low-dose BALB/C mice bone marrow or combining splenocyte. The survival status was observed.3 months post infusion the mixed lymphocyte reaction was established to evaluate the donor-specific immune reaction.【Results】The recipients survived well and there was no graft-versus-host-disease. Mixed lymphocyte reaction was lower in the combining infusion than bone morrow single infusion but no significant difference was observed.【Conclusions】The donor splenocyte infusion combining lower dose bone marrow infusion can modulate the specific immune response in recipients, and the mixed lymphocyte reaction is a valuable system to evaluate the effect and the immune status.
Key words: bone marrow infusion; splenocyte; mixed lymphocyte reaction
尽管近年来新的免疫抑制剂明显改善了移植物近期存活状况,但随之也带来肿瘤、感染、代谢紊乱等副作用,同时移植物长期存活并未获得改善 [1]。虽然供者骨髓输注近来在实体器官移植领域已有成功应用,但这一方法需要大剂量的骨髓细胞,因此影响其在临床上的应用[2]。进一步探讨其内在机制并据此寻找效果更明确、临床可操作性更强的方法很有必要。本研究探索了在供体骨髓细胞输注同时联合脾细胞输注对受体特异性免疫状态的调节效应。
材 料 和 方 法
1.动物
采用8-12周龄BALB/C小鼠(H-2d)为供体,C57BL/6小鼠(H-2d)为受体。
2.供体骨髓细胞和脾细胞制备
处死BACB/C小鼠,无菌获取股骨和胫骨。用5ml注射器灌洗骨髓腔,将骨髓悬浮于含10%FBS的冷RPMI1640溶液中,70μm尼龙膜过滤,凋整细胞密度至10×106/ml。适度积压供体脾脏块同法制备脾细胞悬液,调整细胞数至5×107/ml。
3.骨髓细胞和脾细胞输注及实验分组
自C57BL/6小鼠尾静脉注射1ml供体细胞悬液。按输注种类分组为对照组: 1ml PRMI 1640溶液;骨髓细胞输注组:5×106骨髓细胞;联合输注组:5×106骨髓细胞+5×106脾细胞。每组6只受体。
4.混合淋巴细胞培养体系的建立
输注后3月处死C57BL/6小鼠,制备脾细胞悬液,取1×105细胞作为反应细胞。1×105 BACB/C小鼠脾细胞3Gy照射后作为刺激细胞,C3H系小鼠1×105 脾细胞3Gy照射后作为无关抗原刺激细胞进行参照。刺激细胞和反应细胞置于96板孔中,同一样本重复3孔取平均值。反应体系为:200ul RPMI1640液,10%FBS,70mmol/L 2-硫基乙醇,2mmol/L谷氨酸,100u/ml青霉素,100u/ml链霉素,5%CO2 37℃孵育72小时。反应终止前16小时加入1μCi的3H-胸腺嘧啶。收集反应体系细胞后测定放射活性。设定无关抗原刺激细胞的放射活性为1,比较各样本结果。
结 果
输注后3月供体小鼠均存活,精神可,体重略增加,提示骨髓细胞和/或联合脾细胞输注这一免疫学干预措施对供体本身无显著影响,移植物抗宿主反应强度较低,细胞输注的剂量是合适的。
混合淋巴细胞培养对照组4.09±0.20,骨髓细胞输注组3.36±0.63,联合输注组2.89±0.41。对照组与骨髓细胞输注组和联合输注组有显著性差异,p<0.05, 骨髓细胞输注组与联合输注组结果间虽有差异,但无统计学上显著性差异,p>0.05。说明骨髓细胞输注与联合输注均下调了受体针对供体的特异性免疫反应。虽然尚未达到更显著的程度,但联合脾细胞输注虽较单纯骨髓细胞输注下调更明显, 提示联合脾细胞输注可以在减少骨髓细胞输注量时仍有效调节受体特异性免疫状态。
讨 论
骨髓干细胞输注诱导供体特异性耐受在不同的动物模型中已有成功报道 [3-5]。骨髓干细胞输注诱导耐受,机制可能与克隆无能、否决效应、不成熟DC细胞、嵌合体的形成、相关调节性T细胞的生成等有关。嵌合体(Chimerism)存在可能是DST作用的重要机理之一,骨髓细胞中造血干细胞比外周血干细胞多10-100倍,因而输供体骨髓比输供体血更易形成嵌合体 [6]。
骨髓干细胞输注调节特异性免疫应答所需的细胞数量较大,本研究中所应用的骨髓细胞量相对较少,以研究联合脾细胞输注的效应。脾脏是移植后重要的效应器官,脾细胞中富含各类免疫细胞,联合脾细胞输注可能加强上述骨髓干细胞输注的相关效应。脾细胞骨髓联合输注既让受体负荷供者抗原,又有效地调整受体免疫反应的状态,从而在保持效果的同时减少骨髓细胞输注的数量,使骨髓干细胞输注更具备临床可操作性。本实验的结果也证明了这种设想。但脾细胞为何能强化骨髓细胞输注的免疫调节效应,是何种细胞承担主要作用,有待分离纯化的脾细胞输注后再作进一步观察。
在输注后三月,小鼠体内的免疫状态已逐步接近免疫稳态,此时获取受体的脾脏,以全脾细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞培养体系,结合了体内和体外检测手段的优点,可以直观地观察二级淋巴器官针对特异性抗原免疫反应的整体状态,简便易行,结果明确。为下一步实体器官移植的在体实验提供了基础免疫学的支持。
参 考 文 献
1. Dunn DL. Problems related to immunosuppression. Infection and malignancy occurring after solid organ transplantation. Crit Care Clin. 1990;6(4):955-977.
2. Rapaport FT, Bachvaroff RJ, Watanabe K, et al: Cellular factors. Immunologic tolerance: irradiation and bone marrow transplantation in induction of canine allogeneic unresponsiveness.Transplant Proc. 1977 ;9(1):891-894.
3. Billingham RE, Brent L, Medawar PB. Activity acquired tolerance of foreign cells.Nature. 1953 ;172(4379):603-606.
4. Wekerle T, Kurtz J, Ito H, et al. Allogeneic bone marrow transplantation with co-stimulatory blockade induces macrochimerism and tolerance without cytoreductive host treatment. Nat Med. 2000;6(4):464-469.
5. Hale DA, Gottschalk R, Umemura A, et al. Immunologic mechanisms in tolerance produced in mice with nonradiation-based lymphoablation and donor-specific bone marrow. Transplantation. 2002;74(4):477-484.
6. Henon PR, Butturini A, Gale RP. Blood-derived haematopoietic cell transplants: blood to blood? Lancet. 1991;337(8747):961-963.
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