第3章 可选检测 3.5 计算机辅助精液分析 《人类精液检验与处理实验室手册第五版》

3.5 计算机辅助精液分析

3.5.1 前言

近来，因为难于将精子从非精子的颗粒碎片中区别出来，计算机辅助精液分析（CASA）仍不能用于精子密度的检测(ESHRE, 1998)。然而随着技术的进步，特别是使用DNA荧光染色和尾部检测计数法，已可进行精子密度的测定(Zinaman et al., 1996; Garrett et al., 2003)。如果在样品准备和仪器使用中足够细心，目前CASA仍可用于精子密度的常规诊断。对于建立和维护高标准的仪器操作，严格的质量控制程序是必要的（见第7章）。中国中医科学院西苑医院男科郭军

一些生产商生产CASA系统，这些仪器能检测精子的活动性和动力学，一些还可评价精子密度，少数设备还拥有半自动化的形态学模板。CASA在评价精子活力、密度、形态方面较人工方法具有两个有点：高精确性和提供精子动力学的量化数据（成熟细胞的特点：前向运动和高的活动性）。

一些研究提示，CASA对前向运动精子密度和活动特征的评估结果与体外受精率和受精时间有很好的相关性(Liu et al.,1991a; Barratt et al., 1993; Irvine et al., 1994; Krause, 1995; Donnelly et al., 998;Larsen et al., 2000; Garrett et al., 2003; Shibahara et al., 2004)。利用CASA来检测精液活动力和密度的方法分别在3.5.2和3.5.3小节中介绍，而3.5.4小节则阐述了计算机辅助形态学分析的相关问题。

3.5.2 应用CASA评价精子密度

CASA仪器最好用于精子活力的分析，因为它能够检测到活动的细胞。活力百分比的估计值是不可信的，因为这个数值是在计算不活动的精子数目的基础上得出的，而一些颗粒碎片也可能被混淆其中。

现在已知很多因素都影响CASA仪器的使用，例如样品的制备、读数率、精子密度及计数池的深度(Davis & Katz, 1992; Mortimer, 1994a, b; Kraemer et al., 1998)。如果遵循正确的步骤，可得到可信的和可重复的结果(Davis & Katz, 1992)。可查阅使用CASA参考指南。

用CASA分析精子运动参数时，每个标本中至少追踪200个活动精子。这将需要检测更多数量的精子。如果想把精子按运动能力分类或在一份标本中做变异性的其它分析，至少需要追踪200个，如果可能最好400个活动精子。实验设计应力图使每份标本中被分析的精子数目标准化。

CASA仪器应与可进行数据处理和统计分析的计算机软件结合起来。许多运动参数的标本分布是非正态分布的，因此提倡用中位数而不是用平均值去总结每个运动参数的中心趋势。有必要在进行一定统计学分析之前只对单一精子参数进行数学转换。

3.5.2.1 程序

    每个CASA设备的正确安装对于维持设备良好的性能是至关重要的，并且有赖于预期的使用。制造商提供了适宜的参数，但使用者必须检查每个设备的运行是否达到其所要求的重复性和可靠性。必须使用适当的质量控制材料，如录像磁带（见附录7，A7.5小节）以下作者已经对一般情况下的CASA装置进行了讨论(Davis & Katz, 1992; Mortimer, 1994b; ESHRE, 1998)。

3.5.2.2 标本的制备

用于CASA的精液的采集和处理标准同第2章所述。CASA系统必须将样本保持在37℃，因为精子运动参数具有温度敏感性。在精液未稀释前检测精子活动特性和密度。检测精子活动力，标本密度应控制在2×10⁶/ml到50×10⁶/ml之间(Garrett et al., 2003)。

具有高密度(如高于50×10⁶/ml)精子的标本，通常会增加碰撞的频率，并可能由此出现错误的结果。在这种情况下，建议稀释标本，而同源精浆更适合。

1、16,000g离心一部分精液标本，6分钟，去除精浆。

2、用无精子的精浆稀释原精液样本至其密度低于50×10⁶/ml。

一次性200µm深的计数池可以得到可靠的结果。这是一个双池系统，两个计数池均应被充满并检测。必须检测几个有代表性的视野：每个计数板检测6个视野（共12个视野）以得到可靠的结果。每个计数池至少应该检测200个精子。使用原理相同的质量控制，使活动力的评估标准化（见2.5.2小节）。可以直接分析标本，也可以用录像带记录方法。分析录像（录像带、CD-ROM或DVD）记录的结果可以实现标准化，并按质量保证程序进行（见附录7，A7.5小节）厂家将对录像机的选择以及使精子头和背景产生最大反差的最适照明条件提出建议。

对于获得精确结果所需的追踪精子的时间目前尚有争议。但追踪精子的时间至少是1秒，足以得到基本CASA检测精液的可靠结果(Mortimer, 1994b)。

3.5.2.3 CASA术语

CASA系统检测的参数有一套标准的术语，说明见图3.3。

1、            VCL=曲线速度(µm/s)。精子头沿其实际的曲线，即在显微镜下见到的二维方式运动轨迹的平均速度。检测细胞活力。

2、            VSL=直线速度(µm/s)。根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之间的直线运动的时间平均速度。

3、            VAP=平均路径速度(µm/s)。精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。这个轨迹是根据CASA仪器中的算法对实际轨迹平整后计算出来的；这些算法因仪器不同而有所不同，故不同CASA系统的数值不能直接相比较。

4、            ALH=精子头侧摆幅度(µm)。精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度。以侧摆的最大值或平均数值表示。不同的CASA仪器用不同的算法计算ALH，故不同CASA系统的数值不能直接相比较。

5、            LIN=直线性。曲线轨迹的直线性。VSL/VCL。

6、            WOB=摆动性。精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。VAP/VCL。

7、            STR=前向性。空间平均路径的直线性。VSL/VAP。

8、            BCF=鞭打频率(Hz)。精子曲线轨迹越过其平均路径轨迹的时间平均速率。

9、            MAD=平均移动角度（度）。精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝对值。

3.5.3 应用CASA评估精子密度

应用荧光DNA染色CASA可准确检测活动精子的密度以及活动力的百分比，但需谨慎应用该技术(Garrett et al., 2003)。例如，如果使用一次性计数池，因为精子充满计数池时分布会不均匀，故评估不同位置的精子标本是重要的(Douglas-Hamilton et al., 2005b)。应用血细胞计数板验证是必要的。

可检测的精子密度为2×10⁶/ml-50×10^６/ml之间 (Garrett et al., 2003)。精子密度在50×10^６/ml以上的需要稀释（见35.2.2小节）。

注释：CASA仪器检测并计数荧光染色精子的头部。没有显微的评价就没有其它方法知道精子是否完整（如头尾相粘）。

3.5.4 计算机辅助精子形态学评估

    图像分析在评价精子形态方面，可能带来量化、客观性和可重复性的重大进展。商业系统可用来量化精子头部和中段的形态，主段精子也有可能。然而，精子尾部缺陷对运动的影响可以更直接地通过应用CASA检测活动力和运动状态。CASA系统通常可以将精子头和中段分为正常或异常，并且给出精子头和中段、头部椭圆和规则性以及依赖染色检测的顶体区的平均值和标准差或中位数。

与人工系统相比，自动化系统更具客观性，精确度和重复性的潜力(Menkveld et al., 1990)。精确度和重复性不低于7%(Garrett & Baker, 1995)，这优于有经验的技术人员的手动评估。计算机辅助精子形态学评估（CASMA）结果的重现性和准确性，因为方法的不一致，比如焦距、照明、样品制备和染色的不一致，可能存在诸多问题(Lacquet et al., 1996; Menkveld et al., 1997)；正确的将精子头与精液碎片区分开存在技术上的困难，尤其在精子浓度低时(Garrett Baker,1995；Menkveld et al., 1997; Coetzee et al., 1999a, b)。自动化评价的本质意味着存在制备缺陷和人为影响时没有补救方法。因背景底纹相对细胞染色的微小差异带来的结果的偏差可导致错误精子分类或无法确认精子细胞。

与人工形态学评价一样，程序和仪器必须标准化及质量控制，确保结果可比较、可信。精子可以按照2.13.2.4小节介绍的方式处理，以减少CASMA记录背景的影响。如果精子密度低（<2×10⁶/ml），需要离心浓缩标本，如2.13.2.2小节所述。

注意：离心可影响精子形态，采用必须记录。

两个研究已经提示在CASMA结果与生育力之间存在显著联系。Coetzee 等（1999c）发现自动化的正常精子形态的结果可预测体外受精率和妊娠。Garrett 等(2003)发现精液中具有与透明带结合（Z%）的头部形态特征的精子所占的百分比及直线速度（VSL），与大样本的低生育力夫妇的自然妊娠率是有显著且独立的关系。Z%和VSL与生育力间的关系显示是连续的，而且没有提示妊娠率不再提高的界限值。很多大样本生育力结果的研究要求精制CASA应用程序以检测精子形态。

自动化系统可以为质量控制系统提供数据，但是仍然需要更多的研究证明其临床价值。

（沈阳菁华医院 许蓬译）