第3章 可选检测 3.3 精子-宫颈粘液相互作用 《人类精液检验与处理实验室手册第五版》

3.3 精子-宫颈粘液相互作用

在月经周期（中期）中，当雌激素使宫颈粘液变得易为精子穿透时，精子才可在这一有限的时间内穿透宫颈粘液。精子穿透宫颈粘液时间的长短变化范围很大，因妇女个体而异。即使同一个体，不同的月经周期也不尽相同。因此，只有对不同月经周期进行重复试验，才能对精子-宫颈粘液相互作用的异常作出结论。中国中医科学院西苑医院男科郭军

注：请参阅资料附录5的宫颈粘液的收集，储存和特性评价。

注释：当一个人不能提供一份精液样本时，性交后试验（见3.3.1节）可以提供一些有关他精子的信息。

3.3.1 体内试验

3.3.1.1 目的

性交后试验的目的是确定性交后数小时内宫颈粘液（粘液的储存作用）中活跃精子的数目，评估精子存活数目（Sobrero & MacLeod，1962）和精子的活动情况（Moghissi，1976）。此信息可用于评价男性或女性伴侣阳性抗精子抗体的意义。

3.3.1.2 时间选择

性交后试验应尽可能靠近排卵期进行，排卵期可以根据一些临床指标，例如一般情况下的周期长短，基础体温、宫颈粘液的变化，阴道细胞学检查，血清或尿中雌激素水平及卵巢超声排卵检查。对于一个试验室来说，重要的是使性交后检查宫颈粘液的时间标准化，这一时间应是9～14小时。

3.3.1.3 指导病人

对于准备进行性交后试验病人应告知进行检测的最适时间，同时告知下述事项：

1.试验前至少2天男方要避免性生活及手淫。
2.在约定检验时间的前一天晚上同房。

3.在同房的过程中不能使用任何阴道润滑剂，也不能在性交后进行阴道冲洗（在性交后可以淋浴，但不可使用盆浴）。

4.次日向医生报告您已可以进行检验。

3.3.1.4 步骤

1.先置入未使用润滑剂的阴道窥器。

2.用不带针头的结核菌素注射器、移液管或聚乙烯管在阴道后穹窿部吸取混合样本。

3.再用另一个注射器或导管吸取宫颈管内的粘液标本。

4.将一滴宫颈粘液标本置于载玻片上用盖玻片（规格22 mm × 22 mm）铺平，制备物的厚度可用硅化的100µm玻璃珠进行标准化(Drobnis等, 1988)的控制（见框3.1）。

5.在光学显微镜下以×400放大观察。

注：只有可靠且无血液污染的粘液样本才能保证检验结果的准确性。

框3.1石蜡油混合物的制备

应预先准备好蜡与石油的混合物于室温下储存备用。可在烧杯中熔化蜡(熔点为48-66°C)，用玻璃棒在烧杯中混合矿脂。混合完成后让其自然冷却。当尚有余温时，将其吸入3ml或5ml注射器(无针头)。一旦混合物固化，使用装载注射器提取。

3.3.1.5 阴道中的精液样品

精子在阴道内两个小时就会失活。观察阴道中精子涂片的目的 (参见2.4.2节)是保证精液确实曾存在于阴道内。

3.3.1.6 宫颈粘液样品

精子在宫颈管较低位置的数量取决于时间长短。在性交以后的二个到三个小时之内，有大量精子储积在子宫颈管的较低位置。

穿过宫颈粘液的精子数目的评估一般采取计数高倍镜视野下所见精子数目的方法(参见框3.2)。推荐以粘液中的精子浓度为标准单位（精子数/mm³）表示。

框3.2 显微镜下所能观察到的宫颈粘液的体积取决于显微镜视野的面积和槽的深度(πr²，π约取3.142，r是显微镜视野的半径)。显微镜视野的直径可以通过载物台上的刻度尺或是目镜的孔径除以物镜的放大倍数进行估量。如孔径为20mm的×10倍的目镜和×40的物镜，其显微视野的直径约为500µm（20mm/40），则其半径为r=250µm，r2=62 500µm ², πr2 = 196 375µm ² ，其体积为19 637 500µm ³ 即大约t 20 nl。

因此在放大倍数为400，涂片厚度为100µm，这种情况下计数为10个细胞/HPF则大约为10个/20nl，即等于约500个细胞每µl。然而，因为计数的细胞的总数很低，故抽样误差高。对于10个细胞的样本误差的报告在表2.2中（约为32%）。

精子在子宫颈粘液中的活力分级如下：

● PR = progressive motility;快速前向运动性;

● NP = non-progressive motility; 非快速前向运动性;

● IM = immotile spermatozoa. 非活动精子

正常宫颈功能的最重要指标是精子在其中表现为快速前向运动。

3.3.1.7 解释

●如果未在粘液中发现精子则为测试阴性。

●排除其它明显的性交后宫颈因素，如果在性交后9-14小时内没有在宫颈粘液内发现快速前向运动的精子，或是男方或女方存在抗精子抗体，均有可能是造成不育的因素（Oei等，1995）。

●当观察到非快速前向运动精子表现出一种颤动现象时，则可推断宫颈粘液或是精子表面存在抗体。

注：如果最初的结果是异常或阴性，应该重复性交后的试验。

注释1：如果在宫颈管或在阴道样品中未发现精子，应该询问夫妇以证实阴道内射精的发生。

注释2：试验阴性或归结于不当的时间。在有生育力的妇女中，于月经周期内过早或过迟进行试验也可以出现阴性结果。有些妇女可能在整个月经周期中仅1或2天有阳性结果。如无法合理精确推算排卵时间，则需在月经周期中反复多次作性交后试验或体外试验。为了确定宫颈因素作为可能的不孕原因，需要选择月经周期中最佳时机重复进行对异性的性交后试验。

注释3：在所选择的周期内的最佳时间内重复进行检测，如所得结果总为阴性，则可断定宫颈因素可能为不育的一个原因。

3.3.2 体外实验

使用体外试验对精液-子宫颈粘液相互作用予以详细的评估。通常，当性交后试验结果为异常时才进行这些体外试验，并且使用受捐献者的精液和宫颈粘液进行交叉试验以获得更多的信息。

●当精液子宫颈粘液相互作用试验的目的是比较不同子宫颈粘液标本的质量时，应使用单一的正常精液样本。

●当评估几个精液标本的质量时，应该使用同一种在月经中期的优质宫颈粘液。

注：参见附录5中关于宫颈粘液的收集、存贮和评估细节。

注释1：宫颈粘液的采集可以在妇女的月经中期，预约人工受精的妇女处获得捐献者的宫颈粘液。该妇女可为自然周期或使用促性腺激素诱发的排卵周期。收集宫颈粘液应在授精之前。

注释2：可给予妇女雌二醇7-10天以产生雌化的宫颈粘液(见附录5， A5.2.1节)。

注释3：使用克罗米芬促排卵的妇女不应成为宫颈粘液的供体，因为这一宫颈中的抗雌激素成分可能会对宫颈粘液产生影响。

●应该使用人类月经中期的宫颈粘液。

●应该在收集精液1个小时内做体外测试，防止失水或温度导致精液质量的变化。

●宫颈管内的宫颈粘液的酸碱度应该用范围为6-10的pH试纸在体内或是收集后立即进行测量。如果是在体内测量酸碱度，应注意采取正确适当的方法进行测量，因为宫颈外的粘液总是比宫颈内的粘液的酸碱度要低。应注意不要使酸碱度较低的阴道分泌物污染了宫颈粘液。

●精子对于宫颈粘液的酸碱度的变化很敏感。酸性粘液可使精子制动，而碱性粘液可提高其活力。强碱性的宫颈粘液(pH> 8.5)会对精子的存活产生不利影响。精子能够活动和存活的最适pH值范围为7.0?8.5，这也是月经中期宫颈粘液pH的正常范围。当pH值在6.0?7.0范围时，精子仍能穿透宫颈粘液，但是其活力在低于pH6.5时经常被严重削弱，如宫颈粘液的pH值低于7.0时多无进行检查的必要。

注：替代用凝胶，例如牛的宫颈粘液或合成凝胶，不应考虑作为精液-宫颈粘液相互作用体外试验的人的宫颈粘液代用品。因为使用这些材质无法提供关于精子在粘液中活动能力方面的信息(Neuwinger 等., 1991; Ivic 等., 2002)。

3.3.3 体外简化的载玻片试验

3.3.3.1 步骤

1.将一滴宫颈粘液置于载玻片上，用盖玻片铺平(22 mm × 22 mm)。可使用含有直径100-µm玻璃珠的蜡油凝胶混合物或硅滑脂的盖玻片(见框3.1)，从而保证所制备涂片厚度的标准一致(Drobnis 等, 1988)。

2.载玻片两侧各一滴精液使其与盖玻片的边缘接触，借助于毛细作用使精液移向盖玻片下。这样，就在宫颈粘液与精液之间形成一个清晰的接触界面。

3.水平地存放载玻片在30分钟在37°C在一个湿润的温箱(即在一个有盖的培养皿的水饱和的滤纸)防止变干。

4.在×400倍镜下仔细观察接触面。

3.3.3.2 观察

观察以下特点是否存在：

1.在几分钟内，精液是否在接触面处形成一些指状突起并伸入粘液。这是一种物理特性，不含有精子的精液也会发生(Perloff 和 steinberger 1963; Moghissi等，1964)。

2.多数精子在穿透粘液之前先穿过指状突起通道。在许多情况下，单一精子可引导一纵列精子进入粘液。

3.一旦进入宫颈粘液，精子呈扇型散开并随意游动。有些精子返回精浆，但大多数精子继续向宫颈粘液深处游动，直至遇到细胞碎片或白细胞产生的阻力才停止。

4.精子的移动距离可以达到至少500µm (即大约为10个精子长度)，即离开精液-粘液接触界面的距离。

5.精子是能够活动的(应注意观察活动精子的百分比例以及是否为正向运动)。

3.3.3.3 解释

因为在平面的玻片上使得精液-宫颈粘液接触界面的大小和形状完全标准化是不可能的，故该试验的结果时常带有一些主观性。因此，精液-宫颈粘液互作用仅为一个定性评估。即便如此，基于该结果仍可进行一系列有效地观察。

1.正常结果：精子能够穿透粘液且有超过90%的活动精子为直线运动。

2.较差结果：精子能够穿透粘液，离开精液-粘液接触界面的距离<500 µm (即大约为10个精子长度)。这提示存在精液-宫颈粘液互作用方面的问题。

3.异常结果：包括(1)精子可穿透粘液，但是迅速失活或显示为“抖动”运动，或(2)精液未穿透精液-粘液接触界面。指状突起可以形成或已形成，，但是精子在接触界面的精液侧聚集。提示存在抗精子抗体。

注释：当使用待检夫妇的样品其结果为异常时，应使用供者的精液和宫颈粘液进行交叉试验，以辨别其异常结果是应归因于丈夫的精液还是妻子的宫颈粘液。

3.3.4 毛细管测试

毛细管测试最初是由Kremer设计的(1965)，本法是在一毛细管内测量精子穿透宫颈粘液柱的能力。现已提出多种改良的毛细管试验。本手册推荐地方法基于Kremer的原试验。

3.3.4.1 设备

已使用过各种不同类型的毛细管，但建议使用5 cm长，3mm宽，横切面为0.3mm厚的扁平毛细管。Kremer精子穿透仪(图3.2)的制作过程如下：

1.将横断面为半圆形(直径大约3.5 mm)的三个储液囊(R)粘在一个玻片上。

2.第二个载玻片粘在第一个上。第二张玻璃片应该比第一个短1.5cm，并固定在离储液囊5 mm的位置。这种构造可以防止精液侵入毛细管和玻璃片之间的缝隙。

3.附有厘米刻度玻璃片。

3.3.4.2 步骤

1.获得射精1个小时内的约100µl液化精液样本。

2.将宫颈粘液吸入每个毛细管，且保证没有吸入空气气泡。

3.用毛细管密封胶，塑形黏土或类似的材料，密封每支管的一个末端。封闭时应该用足量的封闭剂，以便使粘液柱稍突出于毛细管的开口端。

4.毛细管的开口端置于玻璃片上，使它深入含有精液标本的储液囊内0.5cm。

5.水平地存放在37°C的潮湿房间内2个小时(如在一个加盖的培养皿中置入饱含水分的滤纸)防止精液和粘液变干。

6.如3.3.4.3节所述，观察毛细管应在放大×100的显微镜下。

7.设备置于37°C孵化器，且在24个小时后为了观察前向运动的精子的表现，应该重复检查毛细管。

3.3.4.3 观察

在2个小时以后，评估迁移距离、穿透密度、迁移所导致的精子减少数目和前向运动精子的数目。

1.迁移距离：测量所浸入精液储液槽的毛细管末端到管中最前面的精子之间的距离。

2.穿透密度：在距浸入精液储液槽内的毛细管末端1cm和4.5cm的两个点处测定。由每低倍镜视野(×100 LPF)下观察到的每个距离点的精子平均数决定。

通过计数五个低倍镜视野而获得平均数。计数均值用穿透密度等级来表示，如表3.3所示。对于测试的分类，以1或4.5 cm的距离下最高的精子穿入密度等级作为检验的结果。

3.迁移减少：通过计算4.5 cm处穿透密度较1 cm处的减少量来获得。以不同等级序号表示。

例1：在1 cm处的穿透密度是51-100/LPF，而在4.5 cm处是6-10/LPF。则迁移减少值是3 (等级序号6减去3) (表3.3)

例2：在1cm处的渗透密度是21-50/LPF，而在4.5 cm处是51-100。则迁移值减少价值是零，因为其穿透密度没有减少，实际上是增加了(表3.3)。

4. 2小时和24小时分别测定在宫颈粘液中出现的前向运动的精子数目。

3.3.4.4 解释

毛细管测试结果可根据下表进行分类

表3.4毛细管检测结果分类表

迁移距离		穿透密度		从1cm到4.5cm迁移减少（等级序号的下降）		在宫颈粘液中前向运动的持续时间（小时）	等级
1		0		-		-	阴性
<3	或	<10	或	>3	或	2	差
4.5	和	>50	和	<3	和	>24	好

所有不能分级的试验结果总结为                          一般