第3章 可选检测 3.2 原理 试剂 步骤《人类精液检验与处理实验室手册第五版》

3.2.1 原理

所有种类的人白细胞均表达一个特殊的抗原（CD45），它可被相应的单克隆抗体检测出来。通过改变一抗的特性，这个常规的检测方法可用于检测各种感兴趣的白细胞，如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、B-细胞或T-细胞。中国中医科学院西苑医院男科郭军

3.2.2 试剂

1.        杜氏PBS（DPBS）：见Appendix 4, section A4.2。

2.        Tris-缓冲液（TBS），pH8.2；见Appendix 4, section A4.8。

3.        四咪唑-HCl（左旋咪唑）：1.0ml/l：将2.4g左旋咪唑溶解于10ml纯水中。

4.        底物：向9.7ml的TBS（pH8.2）中加入2mg的萘酚AS-MX磷酸、0.2ml二甲基甲酰胺以及0.1ml1.0mol/l的左旋咪唑。使用前加入10mg快红（fast red TR salt）并过滤（0.45-μm孔径）。

5.        固定：单用丙酮或丙酮/甲醇/甲醛：95ml丙酮加入95ml纯甲醇、10ml37%（v/v）甲醛。

6.        一抗：鼠抗普通白细胞抗原（编码CD45）的单克隆抗体。

7.        二抗：鼠抗兔免疫球蛋白。根据抗体的滴度及来源选择稀释剂。

8.        碱性磷酸酶：抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）。

9.        Harris’s苏木精染液（作于复染）：见Appendix 4,section A4.10。

3.2.3 步骤

3.2.3.1 精液的准备

1.        充分混匀精液（见框 2.3）。

2.        将一滴约0.5ml的精液与约五倍体积的DPBS混合。

3.        500g离心5分钟，除去上清，将精子沉淀重悬于5倍体积的DPBS。

4.        500g离心5分钟。

5.        重复这一操作一遍并将精子沉淀重悬于DPBS中，使终密度达到50× 10⁶/ml。

3.2.3.2 精子涂片的准备

1.        分别在两张清洁的玻片上滴加5μl精子悬液并制成涂片(见Section 2.13.2)并自然晾干。

2.        固定风干的细胞：纯丙酮固定10分钟或丙酮/甲醇/甲醛固定90秒。

3.        用TBS染两次后自然晾干。

4.        处理后的玻片可直接染色或用铝箔包裹后置于?70 °C冰箱待用。

3.2.3.3 抗体孵育

1.        在每张玻片上用油性笔标记出固定细胞的位置（一个约1cm直径的圈），并在上面加上10 μl单抗。

2.        将玻片水平置于湿盒中，室温孵育30分钟（如可在培养皿中放上吸了水的吸水纸制成湿盒）以防止玻片干燥。

3.        用TBS洗片两次，自然风干。

4.        在相同的位置上加上10 μl二抗，湿盒中室温孵育30分钟。

5.        用TBS洗片两次，自然风干。

6.        在相同的位置加上10 μl APAAP。

7.        湿盒中室温孵育1小时。

8.        用TBS洗片两次，自然风干。

9.        在10 μl磷酸萘酚中温盒室温孵育20分钟。

注：如需增加反应产物，二抗和APAAP的孵育步骤可以重复，每次孵育时间为15分钟。

3.2.3.4 复染和封片

1.        如果玻片变红，用TBS洗片。

2.        用苏木精复染几秒钟，并用流水冲洗。用水溶性封片剂封片。（见Sections 2.14.2.4 and 2.14.2.5）

 

3.2.3.5 计数CD45-阳性细胞

1.        用×200或×400倍的明场显微镜检查整个染色区。CD45-阳性细胞（白）被染红。见（Fig. 3.1）

2.        为了将误差控制在可接受的范围内，每次须至少计数200条精子。同时记录看到的CD45-阳性细胞数。

3.        用计数器计录精子和CD-45阳性细胞数。

4.        用同样的方法分析第二张涂片（至少计数200条精子）。

5.        计算两次计数的CD45-阳性细胞数的总数和误差。

6.        从附件7中的表2.5或图A7.1中查出可接受的误差范围。（它们显示了在两次检测中仅由抽样引起的可接受的最大误差。）

7.        如果误差是在可以接受的范围，计算密度（见Section 3.2.3.6）。如果误差过高，重新计算每次检测的玻片。（见框 2.10）

8.        报告CD45-阳性细胞的平均密度，保留两位有效数字。

9.        计算一次射精平均CD45-阳性细胞总数。（见Section 3.2.3.9后的评论）

3.2.3.6 计算精液中CD45-阳性细胞的密度

根据每张玻片上的精子密度计算CD45-阳性细胞密度。如果N是每张玻片上计数400条精子时计数到的CD45-阳性细胞数，S是精子密度(10⁶/ml)，CD45-阳性细胞的密度（C）(10⁶/ml)可从公式C = S × (N/400)。

3.2.3.7 方法的敏感性

如果在样本中含有的CD45-阳性细胞比精子少（如<400），则样本的误差将超过5%。此时，需要报告计数的细胞数的误差（见表2.2）。

如果计数的CD45-阳性细胞数少于25，报告观察到的CD45-阳性细胞数并注释：CD45-阳性细胞数过少，难以准确计数。

3.2.3.8 示例

例1：在一次检测中，在200条精子中有20个CD45-阳性细胞；在二次检测中，在200条精子中有40个CD45-阳性细胞。则总数（20+40）是60，误差（40-20）是20。从表2.5中可以看到超过了随机误差（15），因此该结果不被接受，需重新检测。

例2：在第一次检测中，每200条精子中有25个CD45-阳性细胞；在二次检测中，在200条精子中有35个CD45-阳性细胞。则总数（20+40）是60，误差（35-25）是10。从表2.5中可以看到在随机误差的允许范围内，结果被接受。

每400条精子中有60个CD45-阳性细胞，精子密度是70 × 10⁶ /ml，CD45-阳性细胞的密度是C = S × (N/400)每毫升=70 × 10⁶ × (60/400) = 10.5 × 10⁶ /ml，或是10 × 10⁶/ml（保留两位有效数字）。由于计数到的细胞少于400个，则根据表2.2报告只计数到60个细胞时可能出现的采样误差（约13%）。

3.2.3.9 参考值

目前尚无关于生育力正常的CD45-阳性的细胞的参考值。目前公认的过氧化物酶阳性细胞的阈值是1.0 × 10⁶/ml (见2.18.1.8节)。由于并不是所有的白细胞都是过氧化物酶阳性粒细胞的，提示总白细胞的密度应更高于这个值。

注释：总白细胞数（一次射精总白细胞数）可能反映了感染的严重程度(Wolff, 1995)。一次射精的总CD45-阳性细胞数可由CD45-阳性细胞密度乘以一次射出的精液总体积得到。

（卢慧）