三磷酸腺苷生物荧光法检测肿瘤药敏的价值

本文发表于肿瘤防治杂志2003年7月第10卷第7期　　CHINA J CANCER PREVTREAT,JUL.2003,Vol.10　No.7
周载平1,　胡泽民1,　季明芳2,　余元龙1,　常晓健1,　陈宏1
1.中山市人民医院普外一科,广东中山528403
2.中山市肿瘤研究所,广东中山528403广东省中山市人民医院肝胆外科周载平

 

【摘要】　目的:探讨三磷酸腺苷生物荧光法(ATP-TCA)评估肿瘤药物敏感性和指导术后化疗的价值。方法:以ATP-TCA法在体外分别检测了59例5种实体瘤细胞对6种化疗药物的耐药率和敏感率。结果:5-FU、MMC、DDP等6种常用化疗药物的耐药率>75%。胃肠肿瘤的化疗药物敏感性差异无显著意义,泰素、羟基喜树碱、丝裂霉素和吡柔比星对肝癌的敏感率分别为91?7%、60?0%、50?0%和42?8%;诺维本、博莱霉素对食管癌敏感率为85?7%、42?9%。结论:ATP-TCA法用于检测肿瘤化疗药物敏感性较为可靠,可作为指导实体瘤术后序贯性化疗的药物筛选手段。
肿瘤防治杂志,2003,10(7):689-691

【关键词】　腺苷三磷酸;荧光光度测定法;抗药性,肿瘤
【中图分类号】　R73-3　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1009-4571(2003)07-0689-03
Value of Adenosine Triphosphate Bioluminescence Assay in Chemosensitivity of Solid Carcinomas
ZHOUZai-ping,HUZe-min,JIMing-fang,et al.First Department ofGeneral Surgery,Zhongshan City People’sHospital,Zhongshan528403,China
Abstract:Objective　To discuss the value ofAdenosine Triphosphate Bioluminescence Assay in the chemosensitivity of solid carcinomas and its guide meaning of postoperational chemotherapy.Methods　Drug resistance and sensitive in 59 specimens of 6 sorts of solid carcinomawere tested byATP Bioluminescence Assay in vitro.
Results　Drug resistance rates of commonly used chemotherapy drugs as 5-FU,MMC and DDP were above 75%.There is no significant difference in chemosensitivities of gastrointestinal cancers.The sensitive rates of
Taxol,HCPT,MMC and THP in hepatocarcinoma were 91?7%,60%,50% and 42?8%,respectively.The sensitive rates of NVB and BLM in esophageal carcinoma were 85?7% and 42?9%,respectively.Conclusion　 ATP-TCA technique is stable and reliable in detecting chemosensitivity of carcinomas,and it can be used to guide sequential chemotherapy of solid carcinomas as drug screening means.
China J Cancer PrevTreat,2003,10(7):689-691
Keywords:adenosine triphosphate;fluorophotometry;drug  Resistance,neoplasms
　　多药耐药基因(mdr-1)和编码蛋白的过度表达,使 经验性的化疗药物对各种肿瘤的治疗有效率越来越低,肿瘤细胞的生物学行为日益恶化,术后无瘤生存期
、复发率高。个体化的化疗策略对提高肿瘤的综合 治疗效果十分重要。近年我们运用三磷酸腺苷生物荧 光法(bioluminescence assay,ATP)体外药敏试验检测
了59例实体肿瘤标本,探讨其对评估实体肿瘤术后细 胞毒药物敏感性的价值。
1　材料与方法
1.1　临床资料
标本取自本院2001年10月-2002年7月59例实 体瘤根治性切除术患者,其中男33例,女26例;年龄28~77岁,平均55?3岁;肝细胞癌14例,胃癌6例,结直肠癌16例,乳腺癌13例,食管癌10例。全部标本均经病理和影像学检查证实;术前均无化学药物治疗史。肿瘤的TNM分期为T113例,T212例,T321例,T413例;Nx3例, N036例,N19例,N27例,N34例;M059例。
1.2　试剂和仪器
检测试剂盒TCA-100 Kit(德国DCS公司原装)含肿瘤消化酶液、完全培养基(CAM)、ATP提取液、荧光素-荧光素酶、ATP标准品、过滤膜和2块96孔培养板等。化疗药物为泰素(Taxol,Brstol-Myers Squibb公司)、草酸铂(OHP,法国Sanofi Winthrop公司)、羟基喜树碱(HCPT,湖北黄石飞云制药公司)、吡柔比星(THP,深圳万乐药业)、顺氯氨铂(DDP,山东齐鲁制药厂)和诺维本(NVB,法国皮尔?法伯公司)等。仪器为
MPL-1型自发光分析仪(德国Berthold公司)、细胞培养显微镜、加液枪和无菌操作台。
1.3　体外药敏实验
按进口商(深圳达科生物技术有限公司)提供的操作手册进行检测。主要步骤如下:术后0?5 h内无菌条件下切取新鲜的实体瘤标本(0?5~2 mm2)并剪碎冲洗,经酶解液酶解,检测培养基孵育2~6 h,离心成细胞悬液,制备肿瘤细胞悬液。测定细胞成活率>80%。
在每种肿瘤的现行经验性化疗方案中遴选出5~6种药物,受检药物按200%、100%、50%、25%、12?5%和6?25%浓度配置。肿瘤细胞悬液加入含化疗药的无血
清培养基中培养1周左右,加入ATP提取液抽提肿瘤细胞的ATP,混匀后再加入荧光素-荧光素酶试剂,在MPL-1型自发光分析仪上检测其荧光值。
1.4　肿瘤药物敏感性的评估
肿瘤生长抑制百分率(TGI)的计算TGI=1.0-(Test-MI)/(MO-MI)×100%
(Test:被测药物孔的平均荧光值;MI:最大ATP生成抑制对照孔的平均荧光值;MO:无药物对照孔的平均荧光值)
利用系统软件描绘药物剂量-抑制曲线,并据曲线得出IC50(抑制50%肿瘤生长的药物浓度)、IC90(抑制90%肿瘤生长的药物浓度)等。
SI(敏感度指数)=600-各个浓度的TGI之和
药物敏感度分级定义:高度敏感为IC90<100%
TDC(药物浓度)和IC50<25%TDC;部分敏感为IC90>
100%TDC和IC50<25%TDC;低度敏感为IC90<100%
TDC和IC50>25%TDC;耐药为IC90>100%TDC和
IC50>25%TDC。
2　结果
2.1　5-FU等基本化疗药物的耐药性表1显示6种实体瘤经验性联合化疗方案的基本
组成药物如5-FU、MMC等的耐药率。考虑到体内环下药物的代谢因素,对各种药物的低度敏感和耐药两者归并计算,结果提示耐药率>75%。
表1　6种基本化疗药物的耐药性

药物      n    耐药率(%)    低度敏感率(%)
5-FU     41       63.8       11.1
MMC      33       57.6       21.2
DDP      41        70.7      14.6
THP      32       46.9       37.5
Vp-16    17        76.5       5.8
OHP      6         75.0         0　
2.2　实体肿瘤的体外药物敏感性比较
泰素、羟基喜树碱、丝裂霉素和吡柔比星对肝癌的敏感率分别为91?7%、60%、50%和42?8%;大肠癌和胃癌的细胞毒药敏结果差异无显著意义;泰素以66?7%、诺维本以85?7%、博来霉素以42?9%的敏感率分别成为乳腺癌和食管癌的相对敏感药物(表2)。
表2　各实体瘤体外药物敏感率比较
组别           n              敏感率(%)
         5-FU MMC   DDP      THP　  Taxol　  HCPT   Vp-16　P值
肝癌      14  8.3   50.0     8.3    42.8     91.7   60.0 - <0.05
胃癌      6    33.3  16.6   33.3    16.6 -   - 0
大肠癌    16  38.5   23.1    30.8   12.5(OHP)  42.9 36.4 >0.05
乳腺癌    13  30.8   20.0    30.8   33.3    66.7 -  14.3(MTX) <0.05
食管癌10 14.2 20.0 14.3 12.5 42.9(BLM) - 85.7(NVB) <0.05
　　注:敏感=高度敏感+部分敏感
3　讨论
传统化疗药物的长期应用使肿瘤细胞耐药现象越来越普遍。据估计,90%的化疗失败和耐药有关[1],表现在药物的有效杀伤周期越来越短。首次化疗和多次 化疗效果迥异,复发肿瘤再次化疗的效果更差,沿用多年的经验性联合方案临床有效率多低于20%。寻找一种有效的药物敏感性分析方法以指导个体化的化疗
来越迫切。ATP-TCA法基于ATP为活性细胞能量 代谢的良好指标这一原理,采用多个药物浓度下活性细胞荧光值的检测。其剂量和抑制曲线的趋势变化线 性分布广,肿瘤生长抑制率分析介于10%~15%的变异系数显示该方法的重复性强[2],同样视野条件下探测细胞活性的能力是MTT法的近20倍[3],所需的细
数量远少于后者,显示其特异的敏感性。本实验对 实体肿瘤的国内常用化疗单药敏感性的分析显示出较高的耐药率,这与临床现象一致,其结果可评估率 >95%。文献报道ATP-TCA法与MTT法的诊断符合 为76?9%~84?6%[4],因而其方法灵敏、结果稳定可靠。该法在国内少数单位用于卵巢癌、血液肿瘤的药 敏检测,预期将来其应用可以进一步拓展。
   序贯性化疗是巩固实体瘤手术疗效的关键,这取 决于肿瘤药物敏感性的阶段性变化。如何预测疗效并指导临床用药至关重要,由于体内外环境的差异决定 了药敏实验对实际疗效预测的局限性,以致即使肿瘤 专科也固守传统方案而忽略了药敏的存在。初步统 计,依照药敏结果开展化疗的比率低于30%。如肝癌 术后的巩固性介入化疗均以蒽环类、铂类、MMC和5- FU等组成。本实验表明,5-FU和铂类药对肝癌的敏
感率均<20%。这从某种角度可以解释重复的介入化 疗效果并不理想和无法根除肝癌生存期短、根治术后复发快的原因。泰素、羟基喜树碱等对肝癌和乳腺癌 显示良好的敏感性,这与临床疗效相符[5,6]。我们的初  步实验显示,不敏感的单药联用并不能改变其敏感性。
     对化疗一向不敏感的肿瘤如食管癌等可能借助敏感药物(本实验中诺维本的体外敏感率达85?7%)的细胞 毒效应产生部分抑瘤作用。总之,药物敏感性实验给
传统的化疗观念带来挑战,依据药敏结果实施个体化 和动态化的化疗策略势在必行。
【参考文献】
[1]　中华医学杂志编委会.全国肿瘤耐药和肿瘤化疗药物临床应用学
术会议纪要[J].中华医学杂志,2001,81(24):1481-1483.
[2]　Andreotti PE,Cree IA,Kurbacher CM,et al. Chemosensitivity testing
of human tumors using a microplate adenosine triphosphate lumines-
cence assay:clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carci noma[J].Cancer Res ,1995,55(22):5276-5282.
[3]　Petty RD,Sutherland LA,Hunter EM,et al. Comparison of MTT and
ATP-based assays for the measurement of viable cell number[J].J Bi-
olumin Chemilumin,1995,10(1):29-34.
[4]　赖启明,金宝翠,刘立华. ATP生物发光测定白血病细胞体外药物 敏感试验[J].南京铁道医学院学报,1996,15(2):74-75.
[5]　夏伟,胡瑞霞,吴熙中,等.泰素介入动脉灌注治疗晚期肿瘤[J].
中国肿瘤临床与康复,2001,8(3):94-95.
[6]　李翔武,谷文韬,梁兆玉.羟基喜树碱经肝动脉介入治疗原发性肝
癌的临床研究总结[J].中国肿瘤临床,2000,27(5):396-397.
收稿日期:2002-11-05