HPV感染的诊断性检测

人乳头瘤病毒（HPV）是最常见的性传播感染病原体之一，也是引起肛门和生殖器及其它器官恶性变的一个重要原因。HPV也与非瘤性疾病如皮肤疣、复发性呼吸道多发性乳头瘤病相关。HPV相关的宫颈癌是全球范围内妇女第二种常见癌症，也是发展中国家妇女最常见的恶性病变。全世界每年有45万例确诊病历，导致死亡的接近25万例。解放军总医院第一附属医院皮肤科李蕾

肛门癌是较少见的癌症，但近年来在男性和女性的发生率都在升高。在相关人群如男性同性恋、感染HIV的男性和女性、有宫颈癌前病变的女性和器官移植接受者中肛门癌发生率最高。据估计所有性活动频繁的成年人会在他们的有生之年接触到HPV，研究显示20%的妇女在任何一次的宫颈检查中可测到HPV DNA。HPV和肛门与生殖器恶性病变的联系使得使用HPV检测来对肛门和宫颈癌进行筛查和监测成为可能，同时它也可以用来判断是否需对相关人群进行预防和治疗性免疫。虽然HPV与另一些生殖器（如阴茎、肛门、肛周、女性外阴）和非生殖器（如口咽和舌）的损害与恶性变也有关联，但本文关注的焦点是HPV检测在宫颈癌诊断中的应用。

HPV的生物学性状和分类
乳头瘤病毒是没有包膜的DNA病毒，直径55nm，有一个20面体的衣壳，含有一个双股环状DNA基因组，7900对碱基。HPV基因组有3个功能区：1）非编码上游调节区，调节DNA复制和特异性编码序列或开放读码框（ORF）的转录；2）早期ORF(E1-E7)；3）晚期ORF(L1和L2)区。由E1-E7 ORF编码的早期蛋白与HPV基因调控和细胞转化有关，由L1-L2 ORF编码的2个后期蛋白构成了病毒衣壳。其中，2个最重要的与恶性病变发病机理有关的HPV蛋白是由E6和E7编码形成的，能促进细胞从正常到恶性变的转化。

E6和E7产生的蛋白转化细胞的能力与它们作用于两种调控细胞生长的细胞内蛋白即p53(针对E6)蛋白和成视网膜细胞瘤（Rb）蛋白（针对E7）有关。正常细胞内，染色体损伤后p53可以使细胞停止生长，并允许DNA修复酶开始工作。如果E6 和p53结合 ，p53会被降解，同时因伴随着修复机制无效导致的基因不稳定会造成染色体突变的积聚。Rb与E7 的结合有着相似的结果。在正常细胞内，DNA受损后，Rb会使细胞生长停止，进而诱导了细胞的凋亡。在E7结合到Rb后，细胞生长不受限制及染色体的不稳定性，使得恶性变的可能性增加。其它可能诱发细胞恶性变的HPV蛋白还有E1，E2和E5.

HPV不能在组织培养和实验动物体内生长。不过，目前采用聚合酶链反应(PCR)的分子生物学技术已能对HPV进行分型。一个独特型HPV的定义是其DNA碱基对的同源性与另一个已经确认的HPV型碱基对相比少于90%。这种DNA水平的分型不同于其它病毒的血清学分型方法，如单纯疱疹病毒（HSV）的分型采用抗病毒包膜蛋白型特异性抗体结合位点的不同来区分HSV-1 和HSV-2。

现在已分离出了超过80种不同的HPV类型，其中的40种能引起生殖器疾病。这些类型基于它们与恶性变如浸润性宫颈癌的关联强度被分为高危型HPV（包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73和82），可能的高危型（包括26，53和66）和低危型（包括6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81，和CP6108）。大量研究数据表明，宫颈癌、肛门癌、阴茎癌病变中分离到的最常见类型是HPV16型和18型，但不是所有的浸润性癌都与16型和18型的感染有关。

HPV检测在癌症筛检中的作用
目前宫颈癌筛检主要采用的不是HPV检测而是Pap检测。后者从宫颈部获取脱落细胞标本，固定在玻片上后由病理科技术人员分析细胞异常情况。检测结果异常时患病妇女需进行阴道镜检查和治疗。阴道镜检查使用强光和双目镜来对出现异常细胞的病变部位进行鉴定与活检。病变组织使用乙酸稀释液后会出现典型的白色（乙酸漂白），因此采用乙酸（3%到5%）可以协助阴道镜操作者对病变组织进行确定。随后对可疑病变进行的活检能确定细胞学和阴道镜的检查结果。虽然Pap检测测定高度宫颈损害的灵敏度只有55%--80%，但特异性达到了90%。

HPV 检测广泛用于HPV相关恶性病变的自然史和病因学研究。但目前它正在成为宫颈癌的另一种或是附加的筛检方法。将HPV检测用于宫颈癌检查的基础在于HPV感染与浸润性宫颈癌和癌前病变密切相关。大约在80%的低度宫颈癌前病变的病人体内可以分离出HPV，高度宫颈癌前病变的病人中有90%可以分离出HPV，几乎所有患浸润性宫颈癌的妇女都能分离出HPV。HPV DNA检测检查宫颈癌前病变的灵敏度（84%到100%）通常高于Pap涂片法，但特异性较低（64%到95%）（表1）。在HPV DNA检测中自我采集标本（盲性收集）的灵敏度低于医院或诊所提供的标本。用自我采集的宫颈阴道标本进行HPV DNA检测的灵敏度与Pap检测法相近。

表1.宫颈癌筛检中HPV检测和Pap检测的比较

	HPV检测(HC-2)	Pap检测
方便性	可以自我收集	不能自我收集，需由医护人员操作
灵敏度	84%到100%，可以检查出在Pap检测中表现为假阴性的妇女	44%到88%
特异性	64%到95%，不能分辨是否发病，只能确认感染。HPV感染者中许多人不会发生癌前病变	88%到98%
观察者间的差异	少	多
成本	60美元	20到40美元

如果采集的标本很适当，则宫颈Pap涂片检测可分为“正常”和“异常”（图1）两种。“异常”分类包括从不明意义非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）和非典型鳞状上皮细胞、不排除高度SIL(ASC-H)到更为清晰的异常发现，如低度鳞状上皮细胞内损害（LSIL）和高度鳞状上皮细胞内损害(HSIL).HSIL被认为是真正的宫颈癌癌前病变。现在HPV检测已被美国FDA批准可以优先用于对Pap涂片检测中发现ASC-US的妇女进行检测，只有在被确诊为ASC-US 时才会进行HPV DNA 检测。Pap检测结果是ASC-US并且DNA检测结果是HPV高危型的妇女需进行阴道镜检查，而DNA检查结果不是HPV高危型的妇女则应在一年后重复进行Pap检测（图1）。由美国癌症协会和美国产科和妇科学会推荐的另一个可能进行HPV检测的指征是与Pap检测联合使用以提高30岁以上妇女宫颈癌筛检的间隔时间。如果Pap检测是阴性且没有分离到高危型HPV，那么筛检间隔时间可延长到3年。这一联检法的优势是将HPV DNA检测的高灵敏度和Pap检测的高特异性结合在了一起。也有人建议HPV检测可作为宫颈癌初期筛检的Pap检测方法的补充。当然这个方法有优点也有缺点。HPV感染可以是暂时性的，大部分受HPV感染的妇女不会出现癌前病变。许多不必要的阴道镜检查可能会导致----尤其是对30岁以下的妇女----假阳性结果带来的不必要的心理负担。另一项建议是在确定宫颈损害和治疗后采用HPV检测来进行疾病的监控。

实验室检测的准备
     HPV检测的性能会受到标本的数量、质量和储存方法的影响。标本采集装置（如细胞拭子）很重要，因为它可以最大限度地保证未来用于DNA分析的标本数量。对于盲性采集方法如肛门癌筛检而言，涤纶拭子优于棉拭子，这是因为上皮细胞会附着在棉花上，从而可能造成细胞数量减少。为便于储存与运输，通常采用液态介质----如甲醇固定液或通用采集介质，其优势在于可以采用同一份标本进行分子和病理分析试验。脱落上皮细胞、DNA、RNA和蛋白质标本都能采用这个技术进行保存，这类标本可以即用也可留做未来分析用。一项研究表明，用甲醇固定液采集的细胞储存在-20℃一年后仍可用于HPV-16型E6、E7的实时PCR（RT-PCR）检测。另一项研究显示，用甲醇固定液采集的标本室温储存30天后仍能用于DNA PCR、RNA RT-PCR和免疫组化检测。

当今HPV检测的实验室方法
目前实验室检测HPV感染的方法主要有3种：1）直接探针法（如Southern转移杂交和原位杂交[ISH]），2)信号放大（如第二代杂交捕获[HC2]试验），3）靶扩增（PCR）。

在用于检测HPV量与型的方法中，多数确认或大规模流行病学研究使用的是以MY09/11或GP5/6作为引物的HC2或PCR方法。由于HC2试验无需初级放大，因此它很少受交叉污染和标本采集因素的影响。而这些因素有时可能对PCR试验和结果造成影响（表2）。

表2.HPV检测方法比较

	信号扩增法	靶扩增法	靶扩增法	靶扩增法
实例	HC2	PCR MY09/11	PCR GP5+/6+	SPF-PCR
探针/引物	RNA探针混合物	降解引物	Consensus引物	Consensus引物
检测反应产物	DNA/RNA杂交体	450bp	150bp	65bp
分析灵敏度(fg)	25到75	0.1到100	0.5到10	0.1到10
能检测的HPV类型	13	39	20	43
FDA认证	通过	没有	没有	没有
有无商品化试剂盒	有	有	无	无
潜在的污染	低	高	高	高
HPV与组织病理学的关系	没有	没有	没有	没有
HPV DNA的定量	可以，能得到半定量的结果	可能，但没有标准化	可能，但没有标准化	可能，但没有标准化
提示多重HPV型感染的能力	不能	能	能	能

直接探针法

原位杂交
在这个方法中，DNA探针能直接作用于靶组织，就象免疫组化一样，可以对与组织病理学相关的靶序列进行空间定位。原位杂交能确定HPV存在和疾病表现之间的相互关系，但由于该方法操作繁杂，不适合常规使用。

Southern转移杂交、点杂交和滤膜杂交是其它一些直接探针法，靶DNA在与DNA探针杂交前会结合在滤膜支持物上。目前这类方法主要供研究使用。

信号放大法
    杂交捕获HPV DNA试验
     HC2试验采用RNA探针，能特异性确定一定型别的高危HPV型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68）或低危HPV型（6、11、42、43、44）。根据被确定的HPV是高危型（B）或是低危型(A)的不同，这些长RNA探针被分成2个检测部分。首先，病人标本（整个HPV DNA）分别与两个检测区域杂交，每个部分会形成特异性HPV DNA-RNA杂交体。然后将它加入包被有特异性抗RNA-DNA杂交体抗体的微孔板，形成HPV DNA-RNA 杂交体抗体复合物。而后加入碱性磷酸酶标记的抗体使其与该复合物结合，去除多余抗体和没有杂交的探针后加入化学发光底物，然后用发光仪进行检测。因为阳性对照的化学发光量（以相对光单位RLU表示）与病人标本中的靶DNA量是成比例的，因此基于标本中的光强度可对病毒量进行半定量测定。通常为缩减成本和时间，在临床评估中一般只采用高危型探针。HC2试验是唯一被FDA批准用于宫颈HPV检测方法。目前FDA尚未批准其用于肛门标本HPV感染的检测。

靶扩增法
聚合酶链反应（PCR）
PCR技术采用DNA聚合酶催化特异性引物来选择性地扩增靶HPV DNA。对扩增后的DNA可以采用不同的方法进行检测，如凝胶电泳、点杂交或条带杂交。与HC2试验相比，PCR方法多样，而PCR结果的灵敏度和特异性也取决于各种因素如引物设置、扩增后的PCR产物的大小以及所用DNA聚合酶的不同。PCR能检出标本中的10到100个DNA分子，经30次循环后能将一个双链DNA分子扩增一百万倍，所以它是目前最为灵敏的方法。多数PCR采用针对L1的引物。型特异性试验通过作用于E6/E7有可能检测所有HPV粘膜型。引物GP5/6(扩展版GP5+/6+)和降解引物MY09/11(修正定义PGMY09/11)是最常用的引物。与HC试验不同的是，虽然PCR已被研究领域广泛使用，但FDA迄今仍未批准PCR可以用于宫颈HPV检测。

实验室检测HPV的特殊方法
多重HPV型
多重HPV型感染可能是疾病持续性存在、多处（相对于单个）宫颈损害和低度到高度宫颈癌前病变的一个重要标志。虽然目前尚无明显证据显示不同HPV类型之间的直接分子相互作用会加强其病理作用，但多重HPV型感染在疾病进程中依旧是一个重要的宿主因素，如削弱HPV特异性免疫。不幸的是，被广泛使用的HPV检测系统如HC2试验，并不能区分单一或多重感染。PCR能检测型特异性HPV感染，因此能提示有无多重HPV感染。然而不同的PCR方法其灵敏度和重复性也存在较大差异(如使用GP5+/6+只能检出47%的多重HPV型感染标本，而MY09/11能检出90%)。

病毒量
大量HPV病毒有可能增加发生HPV相关宫颈损害的危险性，但常规病毒量检测的临床意义还不是很清楚，这主要在于检测的方法学存在着很大的不同。HC2试验（半定量）或PCR方法可以进行HPV DNA的定量检测。在进行有效的HPV病毒量评估前应调整标本中的细胞数。目前尚无公认的最佳HPV DNA定量检测，实时PCR将会是一个很有前景的新技术（见下一部分）。

HPV血清学检测
HPV感染的血清学检测通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）来测定针对型特异性L1类病毒颗粒（VLP）的IgM和IgG抗体。HPV血清学检测属于型特异性，用来提示既往或当前感染。从HPV相关疾病的发生到出现血清学阳性试验通常会有几个月的滞后期。HPV VLP ELISA的灵敏度为50%--60%，特异性超过90%。其它血清学试验包括”夹心法”ELISA和放射免疫分析。因为缺少标准化和重复性，作为过去和/或现今HPV感染标志检测的血清学试验并未被临床广泛采用。

HPV检测新的和未来的实验室方法
实时PCR
实时PCR是一个正在发展中的技术，由于它可以检测细胞内容物，因此已被证明可以更为精确地检测HPV病毒量。实时PCR技术采用5’-引物-核酸外切酶试验和一个其信号会随反应过程中DNA量同比例增加的荧光受体。一系列对照研究显示，宫颈癌患者较对照者相比体内会持续存在高剂量的HPV-16病毒量，并且升高的HPV-16病毒量的检出可以早于宫颈癌诊断13年。与HPV-16阴性的妇女相比，体内存在高HPV-16病毒量的妇女发生宫颈癌的风险性要高30倍。采用实时PCR技术的定量HPV PCR的性能仍在研究中，尚未被用于临床。

其它方法
Kleter等已经开发出了作为一种短PCR碎片和检测系统的短PCR片段PCR（SPF-PCR）系统。与MY09/11和GP5/GP6引物设置相比，一个更小的L1高度保守区被作为靶（65bp），而PCR的功效与被扩增的PCR片段的大小成反比例，因而灵敏度得到了提高。相比MY09/11(450bp)，Amplior微孔板（MWP）试验(Roche 公司)也通过扩增HPV L1区（170bp）片段来提高检测HPV感染的灵敏度。然而该方法只是被设计用于检测高危型HPV。与HC2试验具有相同技术的新的杂交捕获-3（HC-3）试验采用已经确定的可与病人HPV DNA杂交的RNA探针。该试验采用特异性针对HPV DNA序列的生物素标记寡核苷酸来捕获HPV DNA-RNA杂交体（代替以前使用的抗DNA-RNA多克隆抗体），因而特异性得到了进一步提高。其它一些新兴技术主要针对高通量检测，如快速捕获系统每8小时可进行450份标本的检测。DNA芯片技术能有可能使HPV检测焕然一新，因为它可以同时分析数千个DNA序列。

HPV免疫与HPV检测
针对HPV感染细胞的预防和治疗性免疫的进展可能会扩大系统性HPV检测的需要。治疗性免疫可以增强已感染HPV个体的细胞介导免疫反应。治疗性免疫方法多样，其中最常用的是采用致瘤性HPV型的E6和E7多肽来激活宿主T细胞。预防性免疫主要采用HPV衣壳蛋白成分（只用L1或联合L2），这些成份可以自行装配成不含HPV DNA的病毒样颗粒，因此不会造成感染但却能在宿主受HPV感染前诱导产生中和抗体。最近开展了最大的随机验证性HPV疫苗接种。超过2000名的妇女接种了HPV-16疫苗，并且100%地达到了预防了HPV-16相关性宫颈疾病的效果。目前治疗性和预防性HPV免疫都是型特异性的，所以HPV检测将在未来治疗性检测中起到确定治疗对象和适合进行预防性免疫的人群的作用。

总结
人乳头状病毒是最常见的性传播感染病原体之一。HPV相关肿瘤如宫颈癌的发病范围遍及全球，是导致死亡的一个主要原因。最近在分子生物学上的进展促进了HPV感染检测方法的发展。在各种不同的方法中，唯一被FDA批准用于宫颈HPV检测的是采用特异性鉴定低危和高危HPV型的RNA探针的杂交捕获第二代试验。目前用于宫颈癌筛检的方法是Pap涂片，它具有很高的灵敏度，HPV检测也渐渐被纳入宫颈癌的筛检方法中。HPV治疗和预防性免疫的进展将扩大系统性HPV检测的需要。

参考文献(略)

作者简介：Peter V. Chin-Hong， MD和Jeffrey D.Klausner， MD， MPH均为加州大学旧金山分校(UCSF)医学系博士。Klausner博士同时担任旧金山卫生署性传播疾病预防中心主任。